食品中常見乳酸菌高效降解發酵性能評價

遲雪梅，張慶芳*

1(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連，116622)2(遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

遲雪梅1,2，張慶芳1,2*

1(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連，116622)2(遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

通過接種亞硝酸鹽(NO2-)純培養液及發酵蔬菜，對Streptococcuslastic，Lactobacillusleicmannii，Lactobacillusbrevis等9種食品常見乳酸菌種進行NO2-降解實驗，并從NiR降解階段和H+降解階段去分析評價該菌降解NO2-的能力。分析認為,Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation，Lactobacillusbrevis具有高效降解NO2-能力，其中Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation在NiR降解階段降解NO2-能力強，但由于該菌產酸能力較強，使其迅速進入H+降解階段，而使NO2-降解速度變得緩慢；而Lactobacillusbrevis一直能夠處于NiR降解NO2-階段，能使該菌所處環境中NO2-被迅速分解。分析認為，由于該菌產酸為異型發酵途徑，產酸量較低，且Lactobacillusbrevis產生的NiR為同步合成型，能快速產生NiR，該菌產生的H+中和其降解NO2-生成的堿性物質，使發酵環境一直處于NiR最適作用pH值(5.0 ～ 6.0)，從而使NO2-被快速降解。

乳酸菌；NO2-降解；性能評價

隨著經濟的發展，工業生產中形成的氮氧化物(NOx)的排放量及農業生產中氮肥的使用量急劇增加，這些氮源導致環境中NO3-和NO2-的含量顯著上升[1]，導致蔬菜中含有大量NO3-。蔬菜腌漬發酵過程中，NO3-可被大腸桿菌等細菌還原成NO2-，其反應過程是不可避免的[2]。

研究表明，NO2-能與蛋白質代謝物反應生成強致癌物亞硝胺和亞硝酸鈉，后者可通過促進細胞分泌TGF-β1和IL-8，誘導人肝癌細胞SMMC-7721上皮-間質轉化，使癌細胞增殖[3]。此外，飲食攝入過多的NO2-會顯著提高膀胱癌、大腸癌的患病率[4-6]。

研究發現乳酸菌具有降解NO2-的作用。乳酸菌對NO2-的降解分為酶降解和酸降解2個階段[7]。在發酵的前期，培養液pH值> 4.5時，乳酸菌對NO2-降解以NiR降解為主；發酵后期，由于乳酸菌本身產生酸，使培養液pH值降低，當pH值< 4.0后，NO2-的降解主要以酸降解為主。乳酸菌發酵是自然發酵過程中的主要發酵過程，在食品中應用廣泛，如Streptococcuslastic、Lactobacillusleichmannii、Lactobacilluscasei、Streptococcusthermophilus、Streptococcuscremoris等應用在制作乳飲料、發酵酸奶及酸乳豆產品中[8-11]；Lactobacillusplantarun、Lactobacillusbrevis、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus等應用于奶油、肉類及蔬菜發酵產品中[12-13]。

本課題組同時采用Streptococcuslastic、Lactobacillusleichmannii、Lactobacilluscasei、Streptococcusthermophilus、Streptococcuscremoris、Lactobacillusplantarun、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus、Lactobacillusbrevis、Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation等9種食品中常見乳酸菌進行降解NO2-研究，并從NiR降解階段和H+降解階段去分析評價高效降解NO2-乳酸菌的發酵性能。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

Streptococcuslastic(Sl)；Lactobacillusleichmannii(Ll)；Lactobacillusbrevis(Lb)；Lactobacillusplantarun(Lp)；Streptococcuscremoris(Sc)；Lactobacilluscasei(Lc)；Streptococcusthermophilus(St)；Lactobacilluscaseisubsprhamnosus(Lk)；Lactobacilluscaseisubsprhamnosusmutation(Ln)，以上菌株為本研究室保藏。

1.2 蔬菜原料

學校附近農貿市場購買。

1.3 培養基及培養液配方

MRS固體培養基[14]。

液體培養基：不加瓊脂，其他成分同MRS固體培養基。

1.3.3 含NO2-的液體培養基

液體培養基中添加入50、100、125、150及250 mg/L的NO2-。

1.4 菌種活化

菌種活化培養基為MRS液體培養基。

一次活化：取純化后穿刺保藏的各菌種試管，分別穿刺3針接于10 mL液體培養基試管中，重復3次，30 ℃培養48 h。

二次活化：取一次活化各菌種菌液，按10%接種量接種于液體培養基擴大培養，30 ℃培養48 h。

1.5 試劑與儀器

HD-1360超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；THZ-312臺式恒溫振蕩，上海精宏實驗設備有限公司；280 型輕便手提壓力蒸氣消毒器，沈陽市醫療器械二廠；BZ-01顯微鏡，德國徠卡；UV-120-02紫外可見分光光度計，上海尤尼科科技儀器有限公司；pHB-4p 酸度計，美國哈希HACH公司。

1.6 方法

1.6.1 蔬菜發酵工藝流程

甘蘭→清洗→燙漂→瀝水→切段→裝瓶→壓石→注鹽水→接種→密封→發酵

1.6.2 蔬菜發酵技術要點

把清洗過的甘蘭葉片放在恒溫水浴鍋中，水溫85～90 ℃，燙0.5～1 min，取出后迅速投入冷水中漂洗；把漂洗后的甘蘭放在篩筐中瀝去表面水分；甘蘭葉片切段3～4 cm；切段后的甘蘭分別裝入滅菌的玻璃瓶(500 mL)中，每瓶裝量250 g，并按實；在裝緊甘蘭的瓶中放一塊無菌石塊，重約80～100 g，配制2%的鹽水溶液，煮沸過濾，晾涼，每瓶注入325 mL；將已培養36 h、OD620值相一致的9種乳酸菌液，各取10 mL，分別加入9個玻璃瓶中，菌液搖勻；無菌瓶蓋密封；于25～30 ℃保溫發酵。

1.7 測定指標及方法

OD620值：吸光度法。

活菌數：平板菌落計數法。

總酸：酸堿滴定。

pH值：酸度計法。

NO2-：鹽酸萘乙二胺法。

標準曲線的繪制：從裝置5 μg/mL亞硝酸鈉溶液的容量瓶中分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL于6支25.0 mL的比色管中，加入2.0 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入1.0 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水定容至25.0 mL，混勻，避光靜置15 min后，于波長538 nm處測吸光度值并記錄。得標準曲線回歸方程為：y= 0.138 74x+ 0.001 41，R2= 0.99 9。

樣品測定[15]：發酵菜10 g，研磨成勻漿(湯汁10 mL，或含NO2-培養液2 mL)→用150 mL水轉移至250 mL容量瓶中→加6 mL飽和硼酸鈉→用0.1 moL/L NaOH調至pH9→65℃溫度下恒溫水浴10 min→冷卻→定容靜置30 min→過濾→取濾液40 mL→顯色→加蒸餾水定容至50 mL→混勻→于波長538 nm處測吸光度值→計算NO2-。同時以等量蒸餾水作空白對照。

NH3：奈斯勒試劑 法。

NO3-：鎘柱還原法[16-17]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵特性的研究

將二次活化后Sl、Ll、Lc等9種乳酸菌液，按等量菌數接入pH7.2的液體MRS培養基中，30 ℃恒溫培養，定時測定培養液總酸，結果見圖1。

圖1 乳酸菌不同時間產酸量變化Fig.1 The change of lactic acid bacteria produce acid in different time

如圖1可知，Ln、Lp、Lc產酸量明顯高于其他6種乳酸菌；Lb、Ll、Lk 稍高于Sl、Sc、St產酸量。

2.2 乳酸菌降解NO2-的研究

2.2.1 乳酸菌降解培養液NO2-含量變化

在含有NO2-(初始濃度為125 mg/L)的MRS液體培養基中，分別接入等量菌數不同乳酸菌種，于30 ℃恒溫培養，定時測定發酵液中NO2-的含量，結果見圖2。

圖2 發酵液中NO2-的含量Fig.2 Content of NO2- in the fermentation broth

從圖2、圖3、圖4可以明顯看出，含有NO2-的培養液中接入的9種乳酸菌都能降解NO2-，其中Ln菌種在12 h內降解NO2-能力顯著高于其他菌種，降解率高達60%，在24 h后降解NO2-變得較緩慢，60 h接種Ln的培養液仍有NO2-殘留；Lb菌種在12 h內降解NO2-能力僅次于Ln，12 h后Lb菌種發酵的培養液NO2-快速被降解，在48 h 時NO2-被全部降解。分別對12h和24 h 9種乳酸菌降解NO2-的降解量進行差異顯著性分析，結果表明12 h，Ln菌種降解NO2-能力顯著高于其他菌種；24 h，Lb菌種降解NO2-能力顯著高于其他菌種。

圖3 12 h發酵液中NO2-的殘留量Fig.3 Residual amount of NO2- in the fermentation broth at 12 h

圖4 24 h發酵液中NO2-的殘留量Fig.4 Residual amount of NO2- in the fermentation broth at 24 h

2.2.2 乳酸菌發酵菜汁中NO2-含量變化

分別接種9種乳酸菌，進行蔬菜發酵，定時測定發酵液中NO2-的含量，結果見圖5。

圖5 發酵菜汁中NO2-的含量Fig.5 The content of NO2- in fermented vegetables juice

由圖5可知，接入乳酸菌種不同，湯汁中NO2-變化曲線也不同；亞硝峰出現時間基本相同，但峰值不同。其中接種Lb，St的菌種的發酵菜在整個發酵過程中湯汁中都檢測不出NO2-，Sc發酵96 h湯汁中檢測不出NO2-，Sl、Ln發酵120 h湯汁中檢測不出NO2-。

蔬菜原料中含有大量的NO3-，發酵初期菜中含有能產生NiR的菌大部分為好氧菌，能使NO3-還原為NO2-，隨著時間的延長，NO2-的積累逐漸增多；而在水下(兼厭氧環境中)乳酸菌開始活動、大量繁殖，產生NiR和酸，從而導致NO2-被降解，也是“亞硝峰”出現的原因[18-19]。接種發酵能使乳酸菌快速成為優勢菌群，NO2-快速被降解，從而使“亞硝峰”的峰值降低；菌種不同，產生NiR及H+的量不同，對“亞硝峰”的峰值大小都會有影響[7-8,20]，如圖5所示。

2.2.3 乳酸菌降解NO2-的pH值變化

對以上3種情況(無NO2-培養液，含NO2-培養液，發酵菜湯汁)的pH值變化進行分析，如圖6～圖8。

圖6 無NO2-發酵液pH值的變化Fig.6 The change of pH in fermentation broth without NO2-

圖7 含NO2-發酵液pH值的變化Fig.7 The change of pH in fermentation broth with NO2-

圖8 發酵菜湯汁pH值的變化Fig.8 The change of pH in fermented vegetables juice

由圖6、圖7比較可知，同一菌種接種發酵，含NO2-培養液的pH值都高于不含NO2-培養液的pH值；由圖7可知，Lb接種發酵過程中，其環境pH值顯著高于其他菌種發酵的環境pH值，pH值一直處于5.5～6.5之間；由圖8可知，接種Lb的發酵菜湯汁pH值明顯高于接種其他菌種發酵菜湯汁的pH值，且pH值在5.0～6.0之間。

實驗中還發現Lactobacillusbrevis無論接種在含有NO2-的培養液中還是在發酵菜中，檢測有NH3的生成。

張慶芳[7]等人認為乳酸菌對NO2-的降解分為酶降解和酸降解2個階段。在發酵的前期，培養液pH值> 4.5時，乳酸菌對NO2-降解以NiR降解為主；發酵后期，由于乳酸菌本身產生酸，使培養液pH值降低，當pH值< 4.0后，NO2-的降解主要以H+降解為主。張慶芳[21]等在相同pH值下，用接種乳酸菌的培養液中NO2-降解量減去未接種乳酸菌中NO2-的降解量，排除了H+對NO2-降解的影響。證明Lactobacillusbrevis產生的NO2-還原酶降解NO2-的最適pH值在5.0 ～ 6.0之間。龔鋼明[8]等人2011年將細胞破碎、通過硫酸銨鹽析方法從Lb(Lactobacillusbrevis)中提取NiR， 其中NiR最適pH 值為pH5.5，酶的Km值為120.5 μg/mL。

2.2.4Lactobacillusbrevis降解NO2-能力的分析

為進一步探明乳酸菌降解NO2-的能力，分別對含有NO2-濃度為0、50、100 和250 mg/L的培養液接種Lactobacillusbrevis，定時檢測培養液中菌數、總酸、pH值和NO2-含量，如圖9、圖10所示。

1-100 mg/L的降解率；2-lg N;3-0 mg/L總酸；4-50 mg/L總酸；5-100 mg/L總酸；6-200 mg/L總酸圖9 菌數、NO2-降解率、總酸的變化曲線Fig.9 The change of the number of bacteria NO2- and total acid

如圖9所示，Lb菌種0～2 h為遲緩期，2～24 h為對數期，24～48 h為穩定期，48 h后進入衰亡期。在8～36 h(菌生長的對數期及最大期的前期)不含NO2-的乳酸菌培養液中，酸積累曲線變化幅度非常大，酸大量增加；而含NO2-的乳酸菌培養液在同一時期(NO2-大量降解階段)，酸的積累非常緩慢。36 h以后，不含NO2-的菌液酸變化不大，曲線變化平緩；而含NO2-的菌液在36h以后(NO2-全部被降解)，酸才開始積累，48 h后快速上升。96 h以后所有菌液酸的積累都接近一致。

通過圖7、圖9可看出，在菌的對數期，接有Lb的NO2-培養液，其NO2-降解一直處于NiR降解階段[7-8]。進而對Lb菌種進行產酶類型分析，見圖10。

1-lgN;2-50 mg/L;3-100 mg/L;4-250 mg/L圖10 NO2- 培養液中菌數、NO2-降解率曲線比較Fig.10 Comparison of the number of bacteria and NO2- degradation rate

由圖10可知，縱坐標與橫坐標的比，即曲線的斜率，也是NO2-降解量與時間的比，即為NiR的催化反應速度。而“在底物濃度足夠高的情況下，酶催化反應速度與酶濃度成正比”[22]。由圖10還可看出在4～36 h ，4條曲線的斜率大小一致，即NO2-降解率曲線與菌生長曲線彈性相同，說明該乳酸菌合成的NiR速度與細胞生長速度緊密聯系。由此可推導Lactobacillusbrevis產生的NiR類型為同步合成型[22]。說明Lactobacillusbrevis在生長的對數期產生大量NiR。

3 討論與結論

3.1 討論

張慶芳[7]等人認為乳酸菌對NO2-的降解分為酶降解和酸降解2個階段。在發酵的前期，培養液pH值>4.5時，乳酸菌對NO2-降解以NiR降解為主；發酵后期，由于乳酸菌本身產生酸，使培養液pH值降低，當pH<4.0后，NO2-的降解主要以H+降解為主。張慶芳[20]等人用接種乳酸菌的培養液中NO2-降解量減去不接種的同一pH值下NO2-的降解量，排除了H+對NO2-降解的影響。證明Lb產生的NiR降解NO2-的最適pH在pH5.0～6.0之間。龔鋼明[8]等人將細胞破碎、通過硫酸銨鹽析方法從Lb(短乳桿菌)中提取NiR，其NiR最適pH 5.5，酶的Km值為120.5 μg/mL。進一步對Lb產生的NiR類型進行分析見圖10，Lb菌種產生的NiR類型為同步合成型。該類型菌種合成酶速度與細胞生長速度緊密聯系，當細胞進入對數生長期，酶大量生成；當細胞生長進入穩定期后，酶的合成隨即停止[22]。我國學者盧海強[23]等人認為NO2-還原酶為誘導酶，誘導酶也是按此模式進行生物合成。

由圖9可知，不含NO2-的乳酸菌培養液中，在菌的生長對數期酸快速積累；在同一生長時期，含NO2-的乳酸菌培養液酸積累非常的緩慢。研究發現NO2-在NiR的作用下可產生NH4+[24-27]。另外，無論在含有NO2-的發酵培養液中還是在發酵菜的湯汁中，檢測有NH3的生成。因此，比較圖7和圖6可看出，乳酸菌產生的NiR降解NO2-生成的堿性物質使發酵環境的pH值回升。

在食品中常見乳酸菌高效降解NO2-發酵性能評價研究中，用9種乳酸菌接種的含NO2-的培養液，在發酵12 h時，菌的pH都在pH5.0～6.5之間，其中Ln降解NO2-顯著高于其他菌種，且降解率高達60%，在24 h后降解NO2-變得較緩慢，60 h Ln接種的培養液仍有NO2-殘留。由圖1可知，Ln產酸量高；由圖6～圖8可知，24 h Ln無論接種在純培養中還是接種發酵菜，其pH值都小于4.0，此時Ln降解NO2-進入H+降解NO2-階段[20]。本研究還將Ln接種在用緩沖液配置的pH值分別為pH3.5、pH4.5、pH5.5的含NO2-的培養液中，12 h檢測NO2-殘留量，見表1。由表1可以看出，該菌種對NO2-降解能力酶降解階段大于H+降解階段。

表1 不同pH值下接種發酵液中NO2-殘留量

本次實驗研究還表明，在發酵中后期，Lb無論是接種在含NO2-的培養液中還是接種發酵菜的湯汁中，其pH值一直處于pH5.0～6.0之間，說明Lb降解NO2-一直處于NiR作用時期[7,8]。從而使得接有Lb菌種的NO2-培養液，NO2-大量降解且48h后NO2-無殘留；接種在發酵菜(經燙漂后菜中NO3-含量為895.23 mg/kg)中，在發酵期間湯汁中檢測不出NO2-，菜中也無NO2-殘留。

3.2 結論

對Streptococcuslastic，Lactobacillusleicmannii，Lactobacillusbrevis等9種食品常見乳酸菌種進行NO2-降解研究，分析認為Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation，Lactobacillusbrevis具有高效降解NO2-能力。Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosusmutation在NiR降解階段降解NO2-能力強，但由于該菌產酸能力較強，使其迅速進入H+降解階段，而使NO2-降解速度變的緩慢。Lactobacillusbrevis一直能夠處于NiR降解NO2-階段，能使該菌所處環境中NO2-迅速被徹底分解。分析認為：由于該菌產酸為異型發酵途徑，產酸量較低，且Lactobacillusbrevis產生的NiR為同步合成型，能快速產生NiR，從而使該菌產生H+中和了NiR降解NO2-生成的堿性物質，使發酵環境一直處于NiR最適作用pH值(5.0 ～ 6.0)，從而使NO2-快速被降解。

4 展望

由于NiR的最適作用pH值為pH5.0 ～ 6.0，因此食品級的NiR粗酶液可以作為中性或偏酸性食品的添加劑來去除食品中的NO2-，以提高食品的安全性；精致純化的NiR液可應用于臨床NO2-中毒患者體內NO2-的清除，以達到解毒的功效；如NO2-作為防腐劑或發色劑來腌制紅肉制品，在食用之前(滅菌之前)可直接加入類似Lactobacillusbrevis的食用乳酸菌液，來清理殘留的NO2-；亦可以采用復合菌劑進行發酵食品生產，如發酵初期可接種類似Lactobacillusbrevis的乳酸菌，使其NO2-大量被降解，發酵一定時間以后，再接種產酸高、風味好的其他食用乳酸菌進行發酵，這樣的高酸發酵食品，既風味好又無或少NO2-殘留。

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CHI Xue-mei1,2,ZHANG Qing-fang1,2*

1(College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China)2(Liaoning Marine Micr-obial Engineering and Technology Center, Dalian 116622, China)

Lactic acid bacteria;NO2-degradation;performance valuation

碩士研究生(張慶芳教授為通訊作者，E-mail：zqf7566@126.com)。

國家高技術研究發展計劃“863”(2007AA021306)；遼寧省自然科學基金(2014020134)

2016-11-14，改回日期：2017-01-03

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706013