VA納米乳制備工藝研究

毛跟年，曹晴，許牡丹，黃萌，周丹，馬可純，周亞麗，賀磊

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)

VA納米乳制備工藝研究

毛跟年*，曹晴，許牡丹，黃萌，周丹，馬可純，周亞麗，賀磊

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)

研究了VA納米乳的制備并對其質量進行評價。運用偽三元相圖篩選出了最佳表面活性劑與助表面活性劑以及二者最優配比，確定的最優工藝為：5.3 g吐溫80與2.7 g丙三醇攪拌均勻，加入2 g VA油，邊攪拌邊滴加去離子水，直至形成澄清透亮乳液，去離子水用量1mL。所制備的VA納米乳為水包油型，粒徑分布范圍為10～40 nm，平均粒徑23.68 nm。將VA納米乳10 000 r/min離心20 min，或常溫放置6個月均未見分層，表明制備的VA納米乳性質穩定。經檢測，納米乳中VA含量41.66 mg/g。

VA；納米乳；偽三元相圖；穩定性

VA(vitamin A)是指具有視黃醇(retinal)結構，并具有其生物活性的一大類物質的總稱，是人和動物所必需的一種營養元素[1]。具有維持視覺正常，基因調控，免疫功能及骨骼發育等生理功能[2]。但是VA作為一種脂溶性的維生素，在水中幾乎不溶，將VA油直接應用于食品、藥品及保健品中，對于生物體的吸收利用率較低[3]。且VA結構中含有較多的不飽和雙鍵，易氧化，穩定性較差[4]，從而影響其功效。所以，提高VA的溶解度和穩定性是一個難題。

納米乳又稱做微乳(ME)，是由水相、油相、表面活性劑及助表面活性劑按照合適的比例所形成的熱力學穩定的膠體分散體系[5-6]。其粒徑為10～100 nm，整個體系外觀透明且黏度低、各向同性。將脂溶性的VA油制成O/W型納米乳，在水中以納米級均勻分散，一定程度上可以提高VA的溶解度，增加其穩定性[7-8]。

本試驗選擇普通的攪拌裝置進行乳化，乳化劑廉價易得，降低了制備成本，為VA納米乳的工業化生產提供保證。作為一種營養添加劑，VA納米乳的制備，解決了VA溶解度低及穩定性差的缺點，在食品與保健飲料等方面有一定應用前景[9]。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

JJ-1型精密增力電動攪拌器，常州國華電器有限公司；YP802N電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；TG-16-WS臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；1200LC高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Zetasizer NANO-ZS90納米粒度表面電位分析儀，英國Malvern公司；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射電子顯微鏡，美國FEI。

1.2 材料試劑

VA(100萬IU/g，食品級)，陜西金冠牧業有限公司；吐溫80(藥品級)，浙江遂昌惠康藥業有限公司；聚氧乙烯清華蓖麻油(EL40，美國藥典國家處方，藥品級)，成都艾科達化學試劑有限公司；無水乙醇、正丁醇、PEG400、丙三醇(藥品級)，四川金山制藥有限公司；蘇丹紅、亞甲基藍，生物染色劑，上海源葉生物試劑有限公司；甲醇(色譜純)，天津市天力化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 VA納米乳制備方法

將油相和表面活性劑按比例混合均勻，向其中緩慢滴加蒸餾水，邊加邊攪拌，開始時體系黏度較低，形成油包水(W/O)型納米乳，隨著水量的增加，體系黏度逐漸增加，繼續滴加蒸餾水，體系又會突然由黏變稀，此時W/O型納米乳發生轉相[10]，即形成水包油(O/W)型VA納米乳。本實驗選用一般的攪拌裝置進行納米乳的制備，相對于超聲、均質等，降低了生產成本，防止制備過程中對藥物產生物理破壞。

1.3.2 表面活性劑的選擇

離子型表面活性劑一般毒性較大，只能應用于外用制劑，故本研究主要采用無毒的非離子表面活性劑[11]，吐溫類HLB值較高，親水性很強。聚氧乙烯氫化蓖麻油HLB值13～15，能和脂肪醇、一些動物油、植物油混均，是一種新型的食品乳化劑[12]。

本試驗需制備O/W型納米乳，故根據HLB值初步選用吐溫80和聚氧乙烯氫化蓖麻油，再按照油相與表面活性劑質量比為1∶9～9∶1，運用偽三元相圖篩選出最佳的表面活性劑。

1.3.3 助表面活性劑的篩選

選用毒副作用小的無水乙醇、正丁醇、PEG400、丙三醇[13]，按照油相與表面活性劑質量比為1∶9～9∶1，運用偽三元相圖篩選最佳助表面活性劑。

1.3.4 VA納米乳配方的優化

根據選定的表面活性劑與助表面活性劑，利用偽三元相圖確定其最優配比。

試驗過程中，記錄相轉變時的耗水量，以VA油、表面活性劑和水分別作為三角形的3個頂點，繪制偽三元相圖，以納米乳形成區域面積大小為指標篩選配方，試驗選擇油相與表面活性劑1∶9～9∶1的比例來篩選配方用量。

1.3.5 VA納米乳的質量評價

(1)乳劑類型的判別：

根據染料蘇丹紅和亞甲基蘭在納米乳中的擴散快慢進行判別[14]，若紅色擴散速度快，則為油包水(W/O)型；若藍色擴散速度快，則為水包油(O/W)型。

(2)納米乳形態與粒徑測定：

(a)形態觀察：使用Tecnai G2 F20 200 kV場發射透射電子顯微鏡觀察。取VA納米乳0.1 mL，稀釋1 000倍后，滴加在銅網上，自然干燥，然后用2%磷鎢酸復染，待干燥后觀察。

(b)粒徑測定：采用Zetasizer NANO-ZS90型激光粒度分析儀進行粒度分析[15]。取VA納米乳0.1 mL，稀釋250倍后，進行檢測。

(3)納米乳中VA含量測定

采用高效液相色譜法[16]測定。

(a)色譜條件。色譜柱：C18(2.8 μm,150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=98∶2；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；波長：利用紫外全波長掃描確定測定波長。

(b)標準曲線的建立。稱取VA對照品3 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，制成0.06 mg/mL VA標準溶液。然后用流動相稀釋該溶液，制成濃度分別為0.012、0.024、0.036、0.048、0.060 μg/mL的對照品溶液，每個濃度分別吸取20 μL進樣，測得峰面積。以濃度對峰面積進行線性回歸，即得到標準曲線方程。

(c)溶液的制備。精密稱取3份VA納米乳樣品各0.06 g，分別編號為1、2、3，50 ℃超聲，冷卻，甲醇稀釋并定容至50 mL，作為供試品溶液。精密稱取不含VA的樣品0.06 g，同法制備，作為陰性對照溶液。2種溶液分別取20 μL進樣。

(d)精密度和重現性試驗。精密度：精密吸取對照品溶液20 μL，重復進樣3次，計算RSD值。

重現性：取同一批樣品，按照上述色譜條件平行測定6份，計算RSD值。

(e)加樣回收試驗。精密稱取供試品溶液適量，加入對照品溶液，甲醇定容至10 mL，配制濃度分別為0.029、0.032、0.035 mg/mL的待測樣品，進樣，測定實測濃度，計算回收率及RSD值。

(4)納米乳穩定性檢驗

(a)外觀 將所制備的納米乳常溫6個月，觀察其外觀、透明度及分層情況[18]，判斷納米乳的穩定性。

(b)高速離心試驗 將VA納米乳于10 000 r/min離心20 min，觀察其外觀是否有變化。

2 結果與討論

2.1 最佳表面活性劑的確定

選擇吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油(EL40)以及二者復配作為表面活性劑，制備VA納米乳，以VA油、表面活性劑及滴加水量為坐標繪制偽三元相圖，如圖1所示。

圖1 不同表面活性劑對納米乳形成區域的影響Fig.1 Effect of different surfactants on the formation of emulsion

由圖1可知，以吐溫80作為表面活性劑制備VA納米乳時形成的微乳區域最大，表明吐溫80作為表面活性劑更易形成納米乳。形成的微乳區域越大，越有利于減少表面活性劑的用量、增加VA的載藥量[19]，故表面活性劑選擇吐溫80較適宜。

2.2 助表面活性劑篩選結果

助表面活性劑從無水乙醇、正丁醇、丙三醇、PEG400中進行選擇，試驗結果如表1所示。

表1 不同助表面活性劑對納米乳形成的影響

由表1可知，當以無水乙醇和正丁醇為助表面活性劑時，乳液出現渾濁，說明并未形成納米乳。而丙三醇與PEG400作為助表面活性劑時，均可形成澄清透明的納米乳，再通過偽三元相圖從丙三醇和PEG400中篩選出適宜的助表面活性劑。

分別以丙三醇和PEG400為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性劑質量比按1∶1進行試驗，試驗結果如圖2所示。

圖2 不同助表面活性劑對納米乳形成區域的影響Fig.2 Effect of differentcosurfactant on the formation of nano emulsion

由圖2可得，與PEG400相比，丙三醇作為助表面活性劑，所形成納米乳的微乳區域面積更大。由于丙三醇易溶于水，且具有一定的親脂性，提高了界面膜的柔順性和牢固性，降低了體系的黏度。作為助表面活性劑，丙三醇還可以調節體系的親水親油平衡值(HLB值)，當其與吐溫80混合后，HLB值與VA更接近，有利于降低體系的油水界面張力[20]，有助于O/W型納米乳的形成，故最終確定丙三醇為制備VA納米乳的助表面活性劑。

2.3 VA納米乳最優配方確定

以吐溫80為表面活性劑，丙三醇為助表面活性劑，設定表面活性劑與助表面活性劑的質量比(Km)為1∶1、1∶2和2∶1進行試驗，試驗結果如圖3所示。

圖3 不同Km對納米乳形成區域的影響Fig.3 Effect of different Km on the formation ofnano emulsion

當吐溫80與丙三醇比例為2∶1時，HLB值與油相最接近，所制備納米乳的微乳區域最大，隨著表面活性劑用量的增加，納米乳更易形成，且粒徑更小。當表面活性劑與油達到一定比例時，體系形成層狀結構，產生最小界面張力，促進了納米乳滴的形成。根據微乳區域大小及納米乳在水中的分散性，確定出最佳配方及制備工藝為：取5.3 g吐溫80與2.7 g丙三醇攪拌均勻，加入2 gVA油，邊攪拌邊滴加去離子水，直至形成澄清透亮乳液，去離子水最終用量為1 mL。

2.4 VA納米乳質量評價結果

2.4.1 納米乳類型的判別

在制備的納米乳中加入油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲基蘭，結果藍色擴散速度較快，說明所制備的乳劑為水包油型。

2.4.2 納米乳形態與粒徑分布結果

VA納米乳形態和粒徑分布分別如圖4、圖5所示。

圖4 VA納米乳透射電鏡照片Fig.4 TEM photograph of vitamin A nano emulsion

圖5 VA納米乳粒度測定結果Fig.5 The results of VA nano emulsion particle size

由圖4、圖5可得，所制備VA納米乳在水中分散呈球形，大小較均勻，沒有黏連，粒徑分布10～40 nm，平均粒徑為23.68 nm，說明VA納米乳的粒徑分布范圍較窄，粒徑較均勻，符合納米乳基本要求。

2.4.3 納米乳中VA含量測定結果

2.4.3.1 最大波長的確定

對所制備的對照品、供試品、陰性對照品在190～500 nm進行紫外波長掃描，結果如圖6所示。

圖6 VA納米乳波長掃描結果Fig.6 The results of wavelength scanning of vitamin A nano emulsion

由圖6結果可得，VA對照品和VA納米乳供試品在325 nm處均有最大吸收峰，而陰性對照與供試品在285 nm處均有吸收峰，其對VA的含量測定不會產生影響，故選擇波長325 nm進行VA含量測定。

2.4.3.2 含量測定

根據所配濃度梯度對照品測定結果，以樣品濃度對峰面積進行線性回歸，得回歸方程為：y=118 861x-270.29，R2=0.999 3，線性范圍：0.012～0.06 mg/mL。取供試品溶液20 μL進樣，測定峰面積，計算可得納米乳中VA含量為41.66 mg/g。

2.4.3.3 精密度和重現性試驗

將對照品進樣3次，所得結果的RSD為0.87%，表明儀器精密度良好；同一批供試品平行測定6次，結果RSD為1.13%，表明該方法重現性好。

2.4.3.4 加樣回收試驗

經測定，3個濃度的加樣回收率分別為101.65%、100.48%、98.95%，平均回收率100.4%，RSD為1.77%，表明測定結果較準確。

2.4.4 納米乳穩定性檢驗結果

2.4.4.1 外觀

由圖7可知，所制備的VA納米乳澄清透亮，常溫下放置6個月未出現渾濁、分層等現象，表明該納米乳穩定性良好。

圖7 VA納米乳穩定性考察結果Fig.7 Results of the stability of vitamin A nano emulsion

2.4.4.2 高速離心試驗

將VA納米乳10 000 r/min離心20 min后仍為澄清、透亮、流動性好、均一穩定的乳液，未出現分層、破乳現象，說明所制納米乳性質穩定。

3 結論

本文制備了水包油型VA納米乳，利用偽三元相圖進行配方和工藝優化，確定最優配比為：2 g VA油，5.3 g吐溫80，2.7 g丙三醇，去離子水1 mL。所制備乳劑粒徑分布為10～60 nm，平均粒徑23.68 nm，該納米乳中VA含量41.66 mg/g，穩定性良好。采用本工藝技術能夠將脂溶性的VA有效地轉變為水溶性的VA納米乳，能夠為脂溶性VA在食品和保健飲料、口服液中的應用提供便利。

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Study on preparation of vitamin A nano emulsion

MAO Gen-nian*, CAO Qing, XU Mu-dan, HUANG Meng, ZHOU Dan, MA Ke-chun, ZHOU Ya-li, HE Lei

(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science&Technology, Xi’an 710021,China)

The preparation of vitamin A nano emulsion was studied and its properties were evaluated. The best surfactant, co-surfactant and the two optimal ratio were screened out by using the pseudoternary phase diagram. The optimal process was as follows: 5.3 g Tween 80 and 2.7 g glycerol, stir evenly, add Vitamin A oil 2g, stir while dropping deionized water, until the forming a clear and transparent emulsion, the amount of deionized water was 1mL. The vitamin A nano emulsion for the preparation was of oil-in-water, the distribution range of particle size was 10-40 nm, the average particle size was 23.68 nm. By centrifuged at 10 000 r/min for 20 min, the vitamin A nano emulsion was stable without stratification at the room temperature for 6 months. The vitamin A of 41.66 mg/g in nano emulsion was detected.

vitamin A; nano emulsion; pseudoternary phase diagram; stability

學士，教授(本文通訊作者,E-mail：maogn@sust.edu.cn)。

陜西省科技攻關項目(2016NY-167)

2016-09-26，改回日期：2016-11-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706039