結直腸癌中長非編碼RNA MT1DP的下調與其不良預后密切

潘軍平+王俊+朱新華+吳亞夫+丁義濤

【摘要】目的：探討假性基因（MT1DP）在結直腸癌（CRC）組織及其癌旁組織中的表達水平，及假性基因（MT1DP）的表達與結直腸癌（CRC）預后的相關性。方法：我們研究了78例患者的CRC組織及其癌旁組織，通過實時定量PCR檢測MT1DP的mRNA表達水平，并進一步評估其在結直腸癌中的臨床價值。結果：在78例CRC組織中有55例的MT1DP表達水平顯著下降（70.5%，P<0.001）。此外，CRC中MT1DP的表達水平與TNM分期（P=0.020）和遠處轉移（P=0.005）密切相關。而且，CRC患者中低MT1DP表達者的總體生存率（OS）及無病生存率（DFS）更低（P分別為0.002和0.006）。另外，單因素和多因素Cox回歸分析進一步明確MT1DP低表達可能是CRC患者的OS和DFS的獨立預后因素。結論：研究結果表明MT1DP低表達與CRC的發生發展密切相關，其有望成為結直腸癌患者一種新的診斷以及預后評價的生物標志物。

【關鍵詞】結直腸癌；長非編碼RNAs；MT1DP；預后

【中圖分類號】R735.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）06-00-01

1.引言：

大量證據表明lncRNAs表達異常與疾病的多樣性密切相關，包括人類惡性腫瘤[5，6]。在結直腸癌中，lncRNAs表達異常與腫瘤生長及轉移密切關聯，而且其中一些在診斷與預測中頗具價值，例如：CCAT1[7]，HOTAIR[8]，UCA1[9]和MALAT1[10]在結直腸癌中高表達，而長鏈非編碼RNALET[11]，MEG3[12]，GAS5[13]以及LOC285194[14]在結直腸癌組織中低表達。

最近發現肝癌中一種新的lncRNA，即金屬硫蛋白1D假性基因（MT1DP），它可以作為一種腫瘤抑制基因抑制肝癌細胞生長。然而，結直腸癌中MT1DP表達與其潛在的臨床病理學作用之間的關系尚不明。在本研究中，我們旨在探索MT1DP在CRC組織及癌旁組織中的表達水平。以及其表達水平與結直腸癌患者臨床病理學特征及預后價值的關系。

2.材料與方法：

2.1 患者的組織樣本

本研究共收集78例人體CRC組織及鄰近正常組織。所有患者均為近兩年在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院接受結直腸癌手術的患者。入組均未接受術前放療或化療。組織樣本在外科手術離體后立即以液氮冷凍并儲存在-80℃用于進一步分析。患者詳細的臨床特征列于表1。隨訪數據通過審查門診患者及通過電話或郵件隨訪患者。總生存期從最初的外科手術日期算起，直到死亡日期或隨訪的最后日期。該項目方案由南京大學和江蘇省醫學會倫理委員會通過，所有患者簽署知情同意書。

2.2 RNA分離和定量實時逆轉錄PCR（QRT-PCR）

根據TRlozol試劑說明書（Invitrogen公司）提取組織樣本的所有RNA。RNA的濃度及純度以分光光度法在260nm和280nm處測定，只有A260/A280的OD值接近1.8～2.0的樣本進行隨后的分析。使用PrimeScriptTMFirstStrandcDNA試劑盒（Takara，大連，中國）并根據其說明書進行反轉錄。qRT-PCR使用SYBRPremixExTaqTMII試劑盒（Takara公司），AppliedBiosystems7500PCRSystem（ABI，TX，USA）。MT1DP引物序列為5-ATTTCTGAGGCGAGAGGACT-3（正向）和5-GCAGGAGCAGCAGTTCTTCT-3（逆向）。GAPDH（內參）序列為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3（正向）and5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3（逆向）。PCR擴增方案如下：95℃下5分鐘，在95℃下30秒進行40個循環變性，在58℃下30秒退火，在72℃下20秒延伸。所有反應一式三份進行，比較循環閾值（CT）的方法和方程2-ΔΔCT用于量化MT1DP的表達水平。

3.統計分析：

組間差異的顯著性應用Studentst檢驗，檢驗或Wilcoxon檢驗進行評價。建立受試者工作特征（ROC）曲線評價診斷價值。生存曲線構建使用Kaplan-Meier方法和通過對數秩檢驗進行比較。單因素和多因素分析在Cox比例風險回顧模型基礎上進行。所有統計分析使用SPSS18.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）。雙側P值小于0.05時認為差異有統計學意義。

4.結果：

4.1 MT1DP在CRC患者中表達下調

如圖1A，B所示，與癌旁組織相比，MT1DP在腫瘤組織中表達明顯下降，P<0.001。78例CRC患者中有55例腫瘤組織MT1DP的表達水平低于癌旁組織70.5%），腫瘤組織比癌旁組織中MT1DP的表達水平低1.52倍。

4.2 CRC中MT1DP下調的診斷價值

我們發現ROC曲線下面積（AUC）為0.714，95%可信區間（Cl）為0.636-0.783，靈敏度為88.46%（95%Cl：79.2-94.6），特異性為51.28%（95%Cl：39.7-62.8），Youden指數（J=0.3974）為最大值，P<0.001。（圖2）。

4.3 CRC患者MT1DP表達與臨床特征的關系

我們根據78例CRC患者腫瘤組織中MT1DP表達水平的中位數為界，將78例患者分為低MT1DP組（n=39）和高MT1DP組（n=39）。結果表明，CRC中MT1DP低水平組與TNM分期（P=0.020）及遠處轉移（P=0.005）存在顯著相關性。相反的，MT1DP表達與其他臨床參數如年齡（P=0.365）、性別（P=0.610）、腫瘤大?。≒=0.103）、腫瘤位置（P=0.640）和腫瘤分化程度（P=0.147）之間無關聯（表1）。

4.4 MT1DP表達與CRC患者預后的關聯

生存分析表明，被分到兩組的患者的總存活率（OS）和無病生存率（DFS）的顯著差異是基于他們MT1DP表達水平的差異。具體表現為CRC患者中MT1DP低表達者的OS和DFS低于那些MT1DP高表達者（對數秩檢驗，P=0.002和0.006，分別如圖3A，3B）。

另外，Cox比例風險分析用于進一步評估MT1DP表達在CRC中對預后判斷的價值。單因素生存分析顯示，腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、遠處轉移和MT1DP表達與CRC患者的OS和DFS顯著相關（所有P<0.05）。相反的，其他臨床病理參數，如年齡、性別和腫瘤位置不是具有統計學差異的預后因子（所有P>0.05，表2）。隨后，多因素Cox比例風險分析顯示MT1DP表達、TNM分期和遠處轉移與CRC患者的OS和DFS顯著相關（所有P<0.05，表2），這提示MT1DP可能是CRC的一個獨立預后因素。

5.討論

CRC仍是導致全球癌癥相關死亡的主要原因之一，其致死的主要原因是腫瘤的侵襲性及轉移[16-18]。根據癌癥統計，大約60%的CRC患者處于轉移的進展狀態。盡管最近已發展出多種治療方法，中晚期CRC患者預后仍然很差。

在本次研究中，我們提供了一種新的候選生物標記物，即MT1DP，用于CRC的診斷、預后判斷和治療?；?8例CRC患者腫瘤與癌旁組織的qRT-PCR結果，我們發現與癌旁組織相比，MT1DP在CRC組織中顯著下調。ROC曲線表明MT1DP表達水平在CRC中具有潛在的診斷價值。我們也發現CRC中MT1DP低表達與TNM分期和遠處轉移密切先關，這提示MT1DP表達情況可以幫助我們預測CRC腫瘤分期和判斷進展程度。連同前面肝癌研究中的發現，即MT1DP可以抑制肝癌細胞增殖和表型改變[15]，我們的數據顯示MT1DP可能在CRC致癌過程中發揮腫瘤抑制物的作用。

另一方面，我們的Kaplan-Meier分析表明MT1DP表達與CRC患者的OS和DFS密切關聯。另外，單因素和多因素Cox風險比例分析進一步揭示MT1DP可能是CRC患者OS和DFS的獨立預后因素。因此，MT1DP可能有助于確定具有較高死亡風險的高風險CRC患者，并可能成為一種更積極的、有效的治療的候選靶點。

總的來說，我們目前的研究首次報道了結直腸癌組織樣本中MT1DP水平的下調與結直腸癌患者的不良預后密切相關。此外，MT1DP有望成為結直腸癌患者預后的獨立危險因素。為結直腸癌患者的診斷及預后評估提供一條新途徑。

參考文獻

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin 2011；61：69-90.

[2]Morris V，Kopetz S.Clinical biomarkers in colorectal cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2013；11：768-76.