大鼠脊髓右半橫斷損傷模型的制備及其評價

決利利

【摘要】目的：通過制備大鼠脊髓損傷模型，觀察其脊髓損傷后行為，為今后進一步對脊髓損傷的研究提供較為可靠的實驗用模型。方法：構建大鼠脊髓損傷模型，隨機分為假手術組和脊髓右半橫斷損傷組。分別在損傷前、損傷后定期進行BBB功能評分，連續觀察大鼠脊髓損傷后運動功能恢復情況。結果：假手術組在不同的時間BBB評分均很高，而脊髓損傷組評分較低。結論：通過本研究所制備的大鼠脊髓右半橫斷損傷模型，操作簡便、穩定可靠、易于復制，對脊髓損傷的研究具有一定的使用價值。

【關鍵詞】脊髓損傷；模型；BBB評分

【中圖分類號】R681 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）06-0-01

前言

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經系統的嚴重創傷，通過制備脊髓損傷模型來研究治療脊髓損傷疾病是臨床上常用的必要手段，而進行脊髓損傷基礎研究的前提就是建立一個適宜的脊髓損傷模型[1]。本研究結合現在臨床治療脊髓損傷的需求，建立了脊髓右半橫斷損傷模型。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠共39只，雌雄不限，體重250～300g，由貴州醫科大學動物實驗中心提供，統一標準飼料喂養。

1.2 方法 將39只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、脊髓右半橫斷損傷1d、1w、2w、3w、4w共6組，每組6只，中間淘汰3只。實驗觀察時間分別在脊髓損傷1d、1w、2w、3w、4w。實驗用動物購入后常規飼養1周，觀察其健康狀況及四肢活動情況，無異常后，各脊髓損傷組大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6ml/kg）麻醉，俯臥位固定于自制的木板上，常規消毒后剪去背部脊椎區毛。75%酒精消毒后，沿T9～T10背部正中線棘突作2～3cm長的切口，切開皮下脂肪和深筋膜直達棘突及棘上韌帶，將椎旁肌從棘突和椎板表面剝離牽開，咬除棘突和椎板。脊髓背部正中剪開長3.5mm長縱向切口，沿正中作3mm長縱向切口貫穿脊髓，橫向剪斷去除右側脊髓。大鼠迅速出現擺尾反射，右側后肢及軀體回縮撲動后右后肢癱瘓，提示造模成功。仔細止血，生理鹽水、甲硝唑依次沖洗創腔，逐層縫合硬膜、椎旁肌、筋膜及皮膚，再次常規消毒皮膚，無菌紗布覆蓋。假手術組只咬除棘突和椎板不損傷脊髓，其他步驟同脊髓損傷組操作[2]。

1.3 形態學觀察 將各實驗組SD大鼠在各時間點用5%水合氯醛經腹腔麻醉后，切取以損傷處為中心長約1.5cm的脊髓組織，4%多聚甲醛固定24h，冰凍切片，經Nissl染色后觀察脊髓損傷的病理變化。

1.4 行為學觀察 本實驗采用BBB（Basso，Beattie，andBresnahanLocomotorRatingScale）[3]運動功能評分法分別對假手術組和脊髓損傷各組進行脊髓神經功能恢復情況的評價。

1.5 統計學方法 本實驗內容數據采用SPSS17.0軟件進行統計處理。實驗數據用均數±標準差（±s）表示，各組數據采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05表示有顯著性差異，以P<0.01表示有非常顯著性差異。

2.結果

2.1 術后一般情況

術后所有大鼠手術切口處皮膚愈合良好，無感染，縫線大多在2～3周內自行脫落，大鼠右側后肢肌肉有不同程度萎縮，左側后肢術后行動不便者也大約在1周內恢復。脊髓損傷組個別大鼠發生右側足趾被自行咬傷，甚至造成足趾脫落，與右側脊髓半橫斷損傷后右側后肢癱瘓及感覺異常有關。極少數大鼠還會出現腹腔積液的表現，推測可能是由于尿潴留或者手術創傷導致的急性腎衰所致。在整個實驗過程中大鼠死亡多因麻醉意外，而感染、自傷、失血過多等原因則少見。故在手術過程中，應嚴格控制麻醉劑量，根據大鼠術前興奮的程度酌情增減麻藥的劑量，另外在手術過程中應嚴格遵循無菌操作原則，避免粗暴的動作和過多損傷動物的組織結構，術后給予精心的護理，分籠飼養，常換籠中墊料等。

2.2 術后后肢功能觀察

術后假手術組雙后肢功能正常，脊髓損傷組大鼠雙后肢均出現癱瘓，1周內損傷處皮下瘀血消除，左側后肢功能一般能恢復正常；術后1周內活動較少，1周以后可用雙前肢拖曳身體及后肢行走，以后右側后肢自主活動隨著損傷時間的延長有不同程度的恢復。

2.3 脊髓損傷后形態學變化

經Nissl染色后觀察，假手術組染色結果無差異，可見尼氏體分布均勻、豐富、顆粒狀且染色較深。脊髓損傷后1d組可見損傷處尼氏體較少，甚至溶解消失；脊髓損傷后1w至4w時損傷處尼氏小體胞質內開始出現小空泡或顆粒樣變性；在脊髓損傷2w至4w，損傷處開始有囊腔形成，隨著脊髓損傷時間的延長在囊腔的邊緣尼氏小體數量增多且集中，而囊腔內的尼氏小體數量極少。

2.4 運動功能評價

脊髓損傷后各實驗組的BBB評分結果見附表。每組隨機分為6只進行BBB評分。BBB評分結果顯示（見附表），假手術組大鼠后肢運動功能于1d后基本正?；謴?1分；脊髓損傷1d時各實驗組大鼠的后肢BBB評分均為0分，傷后1w功能有恢復，隨后的觀察時間點評分逐漸增高，4w時評分達到最高值。從附表可見到傷后4w的BBB評分恢復明顯高于傷后1d至1w（P<0.05）。

3.討論

根據脊髓局部解剖的連續性和完整性特征，我們可將常見的實驗性脊髓損傷模型分為非橫斷性和橫斷性SCI模型兩種。非橫斷性SCI模型沒有明顯的脊髓解剖連續性和完整性的中斷，常用于急、慢性脊髓損傷機制及藥物干預的研究[4-5]。Allen打擊脊髓損傷模型被認為是一種簡便易行、控制性好，可定量且與臨床脊髓損傷機制相似的經典方法，從而廣泛應用于脊髓損傷的各項研究當中[6]，然而它也有一定的局限性[7]。脊髓缺血性損傷模型、鉗夾模型、脊髓壓迫動物模型，因其操作難度或應用范圍較小而未獲得廣泛的應用。橫斷性脊髓損傷模型有明顯的脊髓解剖連續性和完整性的中斷，見于嚴重的鈍性打擊傷、切割傷及火器傷。目前對脊髓損傷后神經功能恢復所進行的動物實驗研究，主要是采用銳利的刀片選擇性的對脊髓進行全橫切和半橫切，從而觀察損傷區域軸突再生、突觸重建及有關神經遞質、細胞移植、神經營養因子等對這一過程的影響及作用。

脊髓損傷后的運動功能評分是評估脊髓損傷程度、觀察脊髓損傷后損傷脊髓自我修復與再生能力的重要措施。BBB評分是目前應用最廣泛的脊髓損傷評價方法，可作為評價大鼠脊髓損傷后運動功能恢復的標準評分方案之一，其評價內容包括身體協調性和后肢運動幅度等多個方面。但此方法易因為主觀因素使其結果失真，所以本研究利用雙盲、雙人獨立評分并取其平均值的方法，盡可能提高運動功能評價的準確性。

目前，國內外學者針對治療脊髓損傷的實驗研究很多，涉及到的研究面很廣，主要有干細胞移植[8]、局部植入神經支架[2]及藥物治療[9]等，但至今未找到行之有效的治療方法。因此建立一種可靠、簡單、實用的脊髓損傷模型是研究脊髓損傷的先決條件。本實驗通過制備與臨床上脊髓損傷患者相似的動物實驗模型，在一定程度上模擬人類脊髓損傷后的病理改變和臨床表現。為研究脊髓受損后神經修復及運動功能改善提供實驗用模型。

綜上所述，在制備脊髓損傷模型時，研究者應根據其實驗目的和具體實驗條件做出科學的選擇。通過本實驗方法建立大鼠脊髓右半橫斷損傷模型，制作過程簡單且易于復制，可用于臨床治療脊髓損傷的相關研究。今后，如何能制造出更加接近臨床狀態、更加可靠、標準化的脊髓損傷模型，仍是我們今后努力研究的方向。

參考文獻

[1]郝琴，韓繼明等.脊髓損傷動物模型的制備[J].山東醫藥，2014，54（39）：100-102.

[2]孫慶治等，局部植入神經干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用觀察[J].山東醫藥，2016，56（43）：44-46.

[3]Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open filed testing in rats.J Neurotrauma，1995，12（1）1-21.

[4]宗少暉，韋波，曾高峰，等.白介素-1受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷后BDNF表達的影響[J].實用醫學雜志，2011，27（2）：205-206.

[5]周開鋒，蔣贊利，茅祖斌，等.17β-雌二醇對大鼠脊髓損傷后神經保護作用的研究[J].中國脊柱脊髓雜志，2007，17（8）：623-627.

[6]Khan T，Havey RM，Sayers ST，et al.Animal models of spinal cord contusion injuries[J].Lab Anim Sci.1999，49（2）：161-172.

[7]Dimar JR，Glassman SD，Raque GH，et al.The influence of spinal canal narrowing and timing of decompression on neurologic recovery after spinal cord contusion in a rat model[J].Spine 1999，24（16）：1623-1633.

[8]馬珊珊，渠瑞娜等.臍帶沃頓膠干細胞移植對脊髓損傷大鼠炎癥因子表達的影響[J].中國組織工程研究，2015，19（27）：3729-3735.

[9]楊函，王松等.抑制鈣蛋白酶對大鼠脊髓損傷后神經功能保護作用研究[J].重慶醫科大學學報，2016，41（8）：813-817.