補腎活血方對AGEs條件下體外純化培養大鼠視網膜Müller細胞HIF-1α介導缺氧信號通路的影響

秦偉，謝學軍，李志英，宋明霞，曹新偉，馬殿偉，榮素然，陳一兵，王雪菁

·論著：實驗研究·

補腎活血方對AGEs條件下體外純化培養大鼠視網膜Müller細胞HIF-1α介導缺氧信號通路的影響

秦偉1，謝學軍2，李志英3，宋明霞2，曹新偉2，馬殿偉2，榮素然2，陳一兵1，王雪菁1

目的觀察在晚期糖基化終末產物（AGEs）條件下，補腎活血方含藥血清對大鼠視網膜Müller細胞的缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）缺氧信號通路的影響。方法采用SD大鼠制備補腎活血中藥含藥血清和空白血清，以終濃度50mg/L的AGEs作為低AGEs條件，終濃度100mg/L的AGEs作為高AGEs條件，將體外純化培養的P2代視網膜Müller細胞分為6組，分別置于加入空白血清、中藥含藥血清、空白血清+低AGEs、空白血清+高AGEs、中藥含藥血清+低AGEs、中藥含藥血清+高AGEs的DMEM培養基中，培養48 h后酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組細胞外液中HIF-1α、血管內皮生長因子（VEGF）含量，逆轉錄-聚合酶鏈法（RT-PCR）測定各組Müller細胞HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量，比較差異。結果1.低AGEs組較正常對照組HIF-1α值有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），HIF-1αmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05），高AGEs組較正常對照組HIF-1α、HIF-1αmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）；低、高AGEs組較正常對照組VEGF、VEGFmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。2.正常中藥干預組HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA值接近正常對照組，差異無統計學意義（P＞0.05）。3.低、高AGEs中藥干預組HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA值均較對應的低、高AGEs組明顯降低，其差異有統計學意義（P＜0.05）。結論補腎活血方含藥血清可抑制視網膜Müller細胞在AGEs條件下HIF-1α介導缺氧信號通路的高表達，這可能是補腎活血方防治DR的機制之一。

補腎活血；Müller細胞；低氧誘導因子；晚期糖基化終末產物；血管內皮生長因子

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥，成人主要致盲疾病之一。DR發病機制包括晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products,AGEs）形成堆積、細胞生長因子異常、多元醇肌醇代謝異常等。其中AGEs的形成和堆積，可導致氧化應激作用增強、血管舒縮調節功能異常、細胞外基質結構和功能異常、白細胞黏滯性增加，并影響視網膜血管內皮細胞、周細胞、視網膜色素上皮（retinal pigmentepithelium, RPE）細胞的生理功能，使視網膜屏障受到破壞[1]，可作為DR微血管病變的獨立危險因素。AGEs在視網膜中不斷聚集，視網膜屏障破壞，視網膜缺血缺氧不斷加重，繼而誘發機體產生相應的一系列適應反應，從而維持機體氧穩態。在此過程中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）起到關鍵作用，它是迄今為止發現的唯一能在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子，是調節細胞內氧代謝的關鍵物質，能誘導下游基因血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor,VEGF）的表達。現已有研究表明[2]，AGEs可通過細胞外調節激酶通路活化HIF-1α，從而刺激VEGF的增加，導致DR的形成發展。視網膜Müller細胞是視網膜缺氧代謝的重要環節，Müller細胞中HIF-1α介導缺氧信號通路，而VEGF是HIF-1α重要的下游靶基因。因此我們推測：了解視網膜Müller細胞在各種病理條件下是如何調控HIF-1α及VEGF的表達，將有助于詮釋視網膜Müller細胞在DR發生發展及治療過程中的作用，有利于尋求在缺血缺氧性眼病中如何利用Müller細胞較神經元耐缺血缺氧的特點，調控其缺氧應答反應過程與程度，以更好地保護視功能。我們的前期研究表明補腎活血方[3-8]是治療DR的一種有效方法，故本實驗旨在研究補腎活血方對AGEs條件下HIF-1α介導缺氧信號通路的影響，從發病機理方面進一步探究補腎活血方對DR患者視網膜Müller細胞的保護作用，為臨床應用補腎活血方治療DR奠定一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

視網膜Müller細胞純化培養：清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠，新生7 d，9只，雌雄不限[成都中醫藥大學實驗動物中心提供（川實動管質第99-11號）]。

補腎活血中藥復方含藥血清：清潔級SD大鼠50只，體質量150～180 g，8～12周齡，雌雄各半[成都中醫藥大學實驗動物中心提供（川實動管質第99-11號）]。

實驗試劑：AGEs（北京博奧森生物技術有限公司）；谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）鑒定I抗兔多克隆抗體（SANTA CRUZ，美國），II抗生物素化羊克兔抗體（SANTA CRUZ，美國）；HIF-1α檢測試劑（Bio-Rad，美國）；VEGF檢測試劑（Bio-Rad，美國）；IQSYBRGreen Supermix（Bio-Rad，美國）。

1.2 中藥含藥血清制備

補腎活血中藥復方（由人參須、丹參、地黃、葛根等組方，成都中醫藥大學提供）。SD大鼠50只，體質量120～150 g，隨機分為補腎活血中藥復方血清組（中藥含藥血清組）、空白對照組（空白血清組）兩組，每組25只，制備對應的動物血清，具體方法同前期研究[8]。

1.3 視網膜Müller細胞原代及傳代培養及鑒定

SD大鼠9只，新生7 d，酶消化法體外純化傳代培養視網膜Müller細胞，透射電鏡觀察視網膜Müller細胞超微結構，GS免疫組化染色鑒定，實驗細胞取用P2代細胞；具體方法同前期研究[8]。

1.4 實驗分組

實驗1組：正常對照組，DMEM培養基，含20%空白血清。

實驗2組：正常中藥干預組，DMEM培養基，含20%中藥含藥血清。

實驗3組：低劑量AGEs組，含20%空白血清的DMEM培養基+終濃度為50mg/L的AGEs。

實驗4組：低劑量AGEs中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養基+終濃度為50mg/L的AGEs。

實驗5組：高劑量AGEs組，含20%空白血清的DMEM培養基+終濃度為100mg/L的AGEs。

實驗6組：高劑量AGEs中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養基+終濃度為100mg/L的AGEs。

1.5 酶聯免疫吸附法測定視網膜Müller細胞HIF-1α表達量

各組相應條件下培育48h，取培養基上清液50μl，按HIF-1α試劑盒說明書方法加入檢測試劑，酶標試劑和生物素標記二抗，37℃，培育1h，洗板5次，37℃，加入A、B顯色液，于10min后加入終止液，10min內測定光密度（OD）計算HIF-1α濃度，單位ng/ml。

1.6 酶聯免疫吸附法測定視網膜Müller細胞VEGF表達量

各組相應條件下培育48 h，取培養基上清液50 μl，按VEGF試劑盒說明書方法加入檢測試劑，酶標試劑和生物素標記二抗，37℃，培育1 h，洗板5次，37℃，加入A、B顯色液，于10min后加入終止液，10min內測定OD值計算HIF-1α濃度，單位ng/ml。

1.7 逆轉錄-聚合酶鏈法測定視網膜Müller細胞HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量

各組相應條件下培育48 h后，逆轉錄-聚合酶鏈法（reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR）測定視網膜Müller細胞HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量，具體方法同前期研究[9]

1.8 統計分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，定量資料采用x軃±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 SD大鼠P1代視網膜Müller細胞培養2 d后倒置顯微鏡像（×100）。圖2 SD大鼠P2代視網膜Müller細胞培養5 d后谷氨酰胺合成酶（GS）染色像（×200）。圖3～圖5 SD大鼠P2代視網膜Müller細胞培養5 d后透射電鏡像（×50000）

2 結果

2.1 視網膜Müller細胞鑒定結果

純化培養原代視網膜Müller細胞，GS染色陽性率大于80%，表現為大量棕色陽性反應位于細胞核及細胞漿內，細胞周圍可見稍淺的免疫陽性反應，勾勒出的帶有終足以及蹼形爪的扁平細胞輪廓，P1代與P2代細胞GS染色陽性率均在85%以上（圖1，圖2）。透射電鏡下見視網膜Müller細胞形態不規則，正常細胞結構完整，細胞表面大量微絨毛，胞質豐富，內含8~10 nm微絲、豐富的線粒體、高爾基體和散在溶酶體，細胞核大，可見1～2個核仁（圖3～圖5）。

2.2 各干預條件下體外純化培養視網膜Müller細胞HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量比較

低、高劑量AGEs組HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA值均較正常對照組升高，補腎活血方含藥血清能降低兩組AGEs干預條件下HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA的表達（P＜0.05）；補腎活血方含藥血清對正常條件下Müller細胞HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量無明顯影響（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠視網膜Müller細胞HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量比較（x軃±s）

3 討論

DR屬祖國醫學“消渴目病”范疇，基本病機為氣陰兩虛、肝腎不足，瘀血阻絡、痰濁內生及痰瘀互結，以肝腎虧虛為本，以瘀為標[10]。因此當以補益肝腎、滋補精血為治本之法，并以活血化瘀通絡之法貫穿治療始終。據此我們自擬補腎活血中藥復方用于治療DR。前期研究表明[3-8]它是治療DR的一種有效方法。缺氧誘導因子-1（HIF-1）能夠通過激活包括VEGF在內的與缺氧相關的眾多因子，從而精確調節細胞代謝中的氧濃度，使組織細胞及機體適應外周環境氧濃度的變化，它是缺氧應答全局性調控因子[11-12]。HIF-1由HIF-lα、HIF-lβ兩個亞單元組成，HIF-1β是基礎表達蛋白，為HIF-1的組成性表達，而HIF-1α是HIF-1的活性亞基、調節亞基，氧分壓嚴格調控其蛋白穩定性及轉錄活性[13]，屬于氧調節蛋白。VEGF是HIF-1α最主要的下游靶基因[14]。VEGF可以通過增加血管通透性，促使血管內皮細胞分裂、移行及細胞外基質形成，從而形成新生血管，是目前已知的最關鍵最主要的血管生成促進因子[15]。臨床研究[16]也表明VEGF水平和增生型糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy,PDR）有直接顯著的關系。高血糖長期得不到有效控制會導致糖尿病患者機體細胞內、細胞外基質發生非酶糖化，形成AGEs的共價物，AGEs的不斷過量形成與堆積，會導致白細胞黏滯性增加繼而破壞血-視網膜屏障，從而引起視網膜持續性缺血缺氧狀態。在此條件下，機體為適應異常低氧環境，HIF-1α作為一種缺氧信號蛋白，將被迅速激活，并誘導下游因子VEGF的異常高表達。Müller細胞自視網膜外界膜縱向向內伸展，穿過整個視網膜至內界膜，是視網膜中最主要的神經膠質細胞。有研究表明視網膜Müller細胞可影響視網膜的代謝狀況，分泌多種生長因子，改變視網膜的免疫狀態，破壞視網膜內的精細結構，并可能參與視網膜神經細胞的損傷及免疫細胞的增殖過程，這些都決定了Müller細胞在DR及其它視網膜血管病變中起到了重要作用[17]。同時，從Müller細胞的形態結構來看，它也最易受到病理因素的影響。在DR的早期即可發現視網膜電圖b波的改變。而視網膜電圖b波主要起源于神經元和Müller細胞[18]，這就提示Müller細胞在DR的早期可能就發生了功能障礙。視網膜Müller細胞是視網膜缺氧代謝的重要環節，Müller細胞中HIF-1α介導缺氧信號通路，而VEGF是HIF-1α重要的下游靶基因。本次實驗結果顯示，低AGEs組較正常對照組HIF-1α值有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。HIF-1αmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05），高AGEs組較正常對照組HIF-1α、HIF-1αmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。低、高AGEs組較正常對照組VEGF、VEGFmRNA值明顯升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。提示視網膜Müller細胞在AGEs條件下HIF-1α介導的缺氧信號通路高表達，這可能是導致DR發生發展的重要途徑。

同時本實驗結果顯示，補腎活血方含藥血清對正常條件下體外純化培養視網膜Müller細胞HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量無明顯影響（P＞0.05），提示補腎活血方含藥血清對正常條件下視網膜Müller細胞HIF-1α介導缺氧信號通路無明顯影響；加入中藥干預的AGEs樣本HIF-1α、VEGF、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達量較對應AGEs劑量未加中藥干預樣本的數值明顯降低（P＜0.05），與正常對照組的數值相當或低于正常對照組（P＜0.05），提示補腎活血方含藥血清能明顯抑制體外純化培養視網膜Müller細胞HIF-1α介導缺氧信號通路的高表達。因此，筆者推測，補腎活血方能抑制糖尿病患者視網膜Müller細胞HIF-1α介導缺氧信號通路的高表達，這可能是補腎活血方防治DR的機制之一。

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Study on influence of Bushen Huoxue decoction on signal pathwaymediated by HIF-1αof RMCs cul- tured in AGEscondition

QINWei,XIEXuejun,LIZhiying,etal.Zhongshan

Hospitalaffiliated to Guangzhou University of TraditionalChineseMedicine,Zhongshan 528400,China

OBJECTIVE To investigate the influence ofserum with Bushen Huoxue(BSHX)decoction on signalpathwaymediated by hypoxia-inducible factors 1α(HIF-1α)of retinalMüller cells(RMCs)cultured in advanced glycation end products(AGEs)condition.METHODS The serum containing Chinesemedicine BSHX decoction and blank serum was prepared using SD rats.The concentration of AGEs in 50mg/Lwas setas low AGEs condition,and 100mg/L as high AGEs condition.The purified P2 retinalMüller cells of newborn and 7 day-ratswere cultured by modified enzyme-digestionmethod.Purified RMCswere divided into 6 groups,allof them were cultured in Dulbecco'sModified Eagle'smedium(DMEM)and thenwereadded in blank serum,medicated serum,blank serum with low AGEs,blank serum with high AGEs,medicated serum with low AGEs,medicated serum with high AGEs under hypoxic condition respectively.After48hrs,the HIF-1α,vascularendothelialgrowth factor(VEGF)expression in extracellular fluid were detected by enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA),while expression ofmRNA of HIF-1α and VEGF in Müller cellswere tested by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and results of different groups were compared.RESULTS The expression of HIF-1αin the low AGEs group was higher than normal controlgroup,but the differencewas of no statistic difference(Ρ>0.05),but the increase of HIF-1αmRNAmade a significantdifference(Ρ<0.05);the expression of HIF-1αand itsmRNA in the high AGEs was significantly higher in contrast to normal control group(Ρ<0.05).The expressionsof VEGFand itsmRNA in the low AGEsand high AGEsgroup were both significantly higher than normal controlgroup(Ρ<0.05).While BSHXmedicine-containing serum had no significanteffect on the expression of HIF-1α,VEGF and theirmRNA compared with normal control conditions(Ρ>0.05).Both the expression of HIF-1α,VEGF and theirmRNA decreasedmore dramatically by BSHX decoction intervention under different AGEs conditions in contrast to corresponding AGEs concentration without intervention(Ρ<0.05).CONCLUSIONS The BSHX serum inhibited the expression ofsignalpathwaymediated by HIF-1αin purified RMCsunder AGEs condition.Accordingly,it might be part of the mechanism explaining effects of BSHX on diabetic retinopathy.

Bushen Huoxue;Müller cells;hypoxia-inducible factors;advanced glycation end products;vascularendothelialgrowth factor

R285.5

A

1002-4379（2017）02-0071-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.001

國家自然科學基金（81072845）；教育部博士點基金-博導類項目（2011513211000）

1廣州中醫藥大學附屬中山醫院，廣東中山528400 2成都中醫藥大學眼科教研室，成都610075 3廣州中醫藥大學第一附屬醫院眼科，廣州510000

謝學軍，E-mail：xxj_chd@yahoo.com.cn