杞精明目湯藥物血漿對結膜松弛癥成纖維細胞TSG-6和PTX3表達的影響

柯梅青，張興儒，項敏泓，李青松，王晗敏，周桂貞

·論著：實驗研究·

杞精明目湯藥物血漿對結膜松弛癥成纖維細胞TSG-6和PTX3表達的影響

柯梅青，張興儒，項敏泓，李青松，王晗敏，周桂貞

目的研究杞精明目湯藥物血漿對結膜松弛癥成纖維細胞腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）和穿透素3（PTX3）表達的影響，探討結膜松弛癥的發病機制及杞精明目湯對其影響作用。方法制備杞精明目湯藥物血漿和無藥血漿，分別用含20%、10%、5%藥物血漿或無藥血漿的細胞全培養基培養結膜松弛癥成纖維細胞，4 h、24 h后分別提取mRNA和蛋白質，采用實時熒光定量PCR（real time PCR）技術和Western blot法檢測細胞TSG-6、PTX3以及基質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3的表達。結果20%和10%的含藥血漿均可有效上調結膜松弛癥成纖維細胞TSG-6mRNA和蛋白的表達，且作用接近（P＞0.05），而5%濃度的含藥血漿對TSG-6mRNA和蛋白的表達無明顯上調作用。三種濃度的含藥血漿對結膜松弛癥成纖維細胞PTX3mRNA和蛋白的表達無明顯作用。三種濃度的含藥血漿均可明顯抑制結膜松弛癥成纖維細胞MMP-1mRNA和蛋白的表達，其中20%和10%濃度對MMP-1mRNA抑制作用較強，效果接近（P＞0.05），其次為5%；20%濃度含藥血漿對MMP-1蛋白表達的抑制作用最明顯，10%和5%濃度對MMP-1蛋白表達的抑制作用無明顯差異（P＞0.05）。三種濃度的含藥血漿均可有效抑制MMP-3mRNA和蛋白的表達，其中對MMP-3mRNA及蛋白的抑制作用最顯著的均為20%濃度的含藥血漿，其次為10%。結論20%和10%濃度的杞精明目湯藥物血漿能有效上調TSG-6的表達；20%、10%、5%三種濃度的含藥血漿對PTX3的表達均無明顯作用；三種濃度的杞精明目湯藥物血漿均能有效抑制MMP-1、MMP-3的表達。

結膜松弛癥；杞精明目湯；腫瘤壞死因子α刺激基因6；穿透素3

結膜松弛癥（conjunctivochalasis,CCh）是過度松弛的球結膜堆積在瞼緣、內、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學異常，并伴有眼部干澀、異物感、淚溢等不適癥狀的一種眼病[1-2]。目前認為CCh是一種常見的年齡相關性老年性疾病，但該病病因及發病機制仍不明了。

臨床研究發現CCh的松弛結膜組織變薄，結膜基質及結膜下Tenon’s囊菲薄甚至溶解消失；相關基礎研究證實CCh結膜基質及Tenon’s囊的溶解、變薄可能與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP），尤其是MMP-1、MMP-3在結膜組織和淚液中的表達量增多、酶活性增強引起MMPs和金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor ofmetalloproteinase,TIMP）比例失衡有關[3-9]。國內外多項研究證實，抗炎蛋白腫瘤壞死因子-α刺激基因6（tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6,TSG-6）和穿透素3（pentraxin3,PTX3）（又稱為TNF-α刺激基因14），在松弛結膜組織及體外培養的結膜成纖維細胞中均有較高表達[10-13]；TSG-6siRNA或PTX3siRNA下調結膜松弛癥成纖維細胞TSG-6或PTX3基因的表達后，均可使MMP-1、MMP-3的表達明顯增加，并且結膜成纖維細胞凋亡明顯增加；TSG-6和PTX3或通過抑制結膜成纖維細胞MMP-1、MMP-3的轉錄和活化及細胞凋亡限制結膜松弛癥的發病進程[12-13]。

本課題組既往研究發現，杞精明目湯藥物血漿可明顯抑制體外培養的松弛結膜成纖維細胞分泌MMPs并有效提高TIMPs的表達[14]，促進MMPs/ TIMPs平衡的恢復，延緩結膜松弛癥發病進程；故本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction,real time PCR）聯合Western blot法進一步檢測杞精明目湯藥物血漿對松弛結膜成纖維細胞胞內MMP-1、MMP-3的影響，并首次研究杞精明目湯藥物血漿對兩種抗炎蛋白TSG-6、PTX3的調控作用，為探討CCh的臨床治療方案提供有價值的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性SD大鼠24只，普通級（CV），體質量（200± 20）g（上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室動物房提供）。杞精明目湯[15]成分：黃精20 g、麥冬20 g、旱蓮草15 g、枸杞子15 g、茯苓10 g、川芎3 g、炙甘草3 g。根據“人和動物之間按體表面積折算的等效計量比值”計算出與70 kg成人用藥量相當的200 g大鼠的等效計量，將藥液濃縮為含生藥3.35 g/ml，于4℃冰箱保存備用。DMEM培養基、青-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液（含0.02%EDTA）（美國Gibco公司）；胎牛血漿、成纖維細胞生長添加物（FGS）（美國ScienCell公司）；Trizol（日本Takara公司）；cDNA第一條鏈合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（瑞士羅氏公司）；引物、熒光探針（MMP-1、MMP-3、TSG-6、PTX3、GAPDH）（上海生工公司）；MMP-1單克隆抗體、MMP-3單克隆抗體（英國Abcam公司）；TSG-6單克隆抗體、PTX3單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、BeyoECLPlus（上海碧云天公司）；BSA（美國Sigma公司）；CO2培養箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺（中國安泰公司）；低溫高速離心機、分光光度計、梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；熒光定量PCR儀ABI7300（美國ABI公司）；酶標檢測儀、垂直電泳槽、轉膜儀（美國BIO-RAD公司）；化學發光分析系統儀（中國培清公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織標本采集實驗所用結膜組織來自2015年1月—2015年6月在上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科行新月形松弛結膜切除術的患者，共6例6只眼，納入患者符合文獻[1]的診斷標準，并屬于結膜松弛癥手術適應癥。本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得上海中醫藥大學附屬普陀醫院倫理委員會批準，對所有樣本提供者進行知情同意并簽署知情同意書。

1.2.2 結膜松弛癥球結膜成纖維細胞培養參照韓竹梅[16]結膜成纖維細胞培養方法：將切取的球結膜組織用0.9%的生理鹽水漂洗3遍，用眼科顯微剪刀將組織剪成0.5～1mm2大小，平鋪于6孔板內，將6孔板翻轉為底朝上，然后置于37℃、體積分數5% CO2培養箱中，待組織塊周邊接近干燥（約1～3min）時將6孔板翻轉，于超凈臺中緩慢加入3ml含體積分數10%胎牛血漿、1%雙抗和1%FGS的DMEM培養液，勿使組織浮起，繼續培養，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及培養情況，并對培養的細胞按照成纖維細胞鑒定方法鑒定[16]。

1.2.3 制備藥物血漿將24只SD大鼠編號，按隨機數字表分為杞精明目湯組和生理鹽水對照組，每組12只。杞精明目湯組給予杞精明目湯灌胃，每次2ml/只，每日2次，連續5 d；生理鹽水對照組給予生理鹽水灌胃，每次2m l/只，每日2次，連續5 d。于最后一次灌胃2 h后（灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥鈉，1.5m l/kg腹腔麻醉后，消毒，無菌操作下打開腹腔，腹腔動脈采血，靜置2 h，2000 r/min離心25min，無菌操作下分離出血漿，56℃水浴滅活30min，0.22μm過濾器過濾后-20℃下保存備用。臨用前用含1%青-鏈霉素的DMEM培養液配制成5%、10%、20%的含藥或無藥血漿。

1.2.4 杞精明目湯藥物血漿刺激實驗選擇3～6代80%融合的對數生長期CCh成纖維細胞，將細胞培養基換為無血漿培養基繼續培養24 h后，棄去培養基，分別加入無藥或含藥血漿終濃度分別為5%、 10%、20%的細胞全培養基，同時設PBS陰性對照組，繼續培養至4 h分別提取各組的RNA用于real time PCR檢測，剩余細胞繼續培養至24 h提取各組的蛋白質，用于Western blot實驗。

1.2.5 real time PCR測結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的表達采用Trizol法提取貼壁成纖維細胞mRNA，進行real time PCR檢測。以oligd（T）18為引物，mRNA模板1μg，合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR按20μl反應體系進行：10×PCR緩沖液10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，熒光探針1μl，cDNA1μl，PCR級ddH2O 6μl。樣品和內參均設3個復孔，同時設無mRNA（空白）對照組和基因組（無逆轉錄酶），引物探針序列見表1。反應條件為：95℃1min，95℃30 s，60℃30 s，共40個循環，ABI7300全自動熒光定量PCR儀進行反應；反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為CT值；目的基因相對表達水平的計算采用樣品各自內源控制物GAPDH的表達量來標準化加入的初始RNA量，即每個樣品靶基因的相對表達水平△CT值=靶基因CT值-GAPDH的CT值；通過比較不同組的△△CT值=△CT1-△CT2，計算2-△△CT值，間接反映各組模板的起始拷貝數之間的倍數關系（real time PCR實驗過程中所用到的耗材均用DEPC水滅活RNA酶）。

表1 目的基因引物序列及產物長度目的基因

1.2.6 Western Blot法檢測結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的表達RIPA裂解細胞提取蛋白質，BCA法檢測蛋白濃度，并調整各組蛋白濃度至同一水平，蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：蛋白上樣量取50μg，上層膠5%，下層膠10%，上層膠電壓80 V，下層膠電壓100 V，垂直電泳1.5 h，半干式轉膜1 h，電壓15 V，將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，HRP標記的山羊抗鼠IgG/HRP標記的山羊抗兔IgG二抗分別室溫孵育對應的一抗1 h，ECL化學發光法曝光，化學發光分析系統儀拍照。以GAPDH為內參，采用Image J分析軟件對條帶進行半定量分析，以TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白灰度值進行計算。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行統計分析。本研究檢測指標的數據資料經W檢驗接近正態分布，以x軃±s進行統計描述，組間均數經Levene檢驗方差齊，各組目的基因、目的蛋白的差異總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 各組CCh結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相對表達量（軃±s）

表2 各組CCh結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相對表達量（軃±s）

注：組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。與對照組比較，①P<0.05；與20%含藥血漿比較，②P<0.05；與10%含藥血漿比較，③P<0.05 CCh：結膜松弛癥TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質金屬蛋白酶1 MMP-3：基質金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

組別樣本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH對照組20%含藥血漿組10%含藥血漿組5%含藥血漿組20%無藥血漿組10%無藥血漿組5%無藥血漿組1.03±0.07 0.47±0.11①0.70±0.17①②0.75±0.12①②③0.97±0.14 0.93±0.12 0.89±0.22 F值P值6 6 6 6 6 6 6 1.07±0.11 1.70±0.20①1.53±0.24①0.97±0.14 1.02±0.10 0.99±0.13 1.03±0.11 1.02±0.12 1.17±0.17 1.07±0.25 0.90±0.25 1.10±0.13 1.00±0.20 0.91±0.14 1.03±0.07 0.40±0.04①0.50±0.06①0.80±0.12①②③1.12±0.14 0.98±0.09 1.01±0.15 22.176＜0.001 1.669 0.158 43.879＜0.001 5.820＜0.001

圖1 Western Blot法檢測各組CCh結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表達的電泳圖TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質金屬蛋白酶1 MMP-3：基質金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2 結果

2.1 杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響

20%和10%的含藥血漿均可有效上調CCh成纖維細胞TSG-6mRNA的表達，且作用接近（P＞0.05），而5%濃度的含藥血漿對TSG-6 mRNA的表達無明顯上調作用；三種濃度的杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細胞PTX3 mRNA的表達無明顯影響；三種濃度的杞精明目湯含藥血漿均可明顯抑制體外培養的CCh成纖維細胞MMP-1 mRNA的表達，其中20%和10%濃度抑制作用較強，數值結果亦無明顯差異（P＞0.05）；20%、10%、5%濃度的藥物血漿均可有效抑制MMP-3mRNA的表達，其中20%的抑制作用最顯著，其次為10%（表2）。

2.2 杞精明目湯含藥血漿對CCh成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響

不同濃度含藥血漿對CCh成纖維細胞各蛋白指標表達的影響與前述對mRNA的影響大致相同。20%和10%的含藥血漿可有效上調CCh成纖維細胞TSG-6蛋白的表達。三種濃度的含藥血漿均可明顯抑制MMP-1蛋白、MMP-3蛋白的表達，對MMP-1蛋白，20%濃度抑制作用最明顯，10%與5%濃度的抑制作用無明顯差別；對MMP-3蛋白，20%作用最顯著，其次為10%。杞精明目湯含藥血漿對PTX3蛋白的表達無明顯影響（圖1，表3）。

表3 各組CCh結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相對表達量（軃±s）

表3 各組CCh結膜成纖維細胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相對表達量（軃±s）

注：組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。與對照組比較，①P<0.05；與20%含藥血漿比較，②P<0.05；與10%含藥血漿比較，③P<0.05 CCh：結膜松弛癥TSG-6：腫瘤壞死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基質金屬蛋白酶1 MMP-3：基質金屬蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

組別樣本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH對照組20%含藥血漿組10%含藥血漿組5%含藥血漿組20%無藥血漿組10%無藥血漿組5%無藥血漿組0.95±0.03 0.25±0.02①0.42±0.01①②0.62±0.05①②③0.91±0.03 0.92±0.04 0.96±0.08 F值P值6 6 6 6 6 6 6 0.877±0.07 1.13±0.09①1.04±0.11①0.93±0.05 0.94±0.04 0.93±0.11 0.89±0.10 1.11±0.05 1.11±0.14 1.08±0.12 1.07±0.16 1.06±0.10 1.09±0.03 1.04±0.11 0.99±0.05 0.10±0.01①0.42±0.10①②0.45±0.02①②0.96±0.11 1.00±0.05 0.96±0.03 6.784 0.003 0.276 0.945 191.236＜0.001 270.868＜0.001

3 討論

西醫對CCh的治療主要采取局部人工淚液滴眼和手術切除。人工淚液只能暫時緩解癥狀，且易反復；手術切除病變組織創傷大，患者不易接受。本研究著眼于中醫，在既往研究的基礎上，為杞精明目湯治療CCh提供理論依據。CCh可歸屬于中醫“白澀癥”范疇，臨床主要表現為眼內干澀不爽，雙目頻眨，羞明畏光，白睛隱隱淡紅，久視后則諸癥加重，伴口燥咽干，頭暈目眩，腰膝酸軟，五心煩熱，夜寐不安，潮熱盜汗，舌紅少苔，脈沉細。病機多為肝腎陰虛，擬方精杞明目湯補腎養陰生津治療。方中枸杞子滋補肝腎，益精明目，黃精健脾益腎，補氣養陰，麥冬養陰生津，共同為君藥，滋補肝腎，養陰生津；脾胃為后天之本，茯苓、炙甘草健脾益氣，以助氣血生化之源；陰虛生熱，旱蓮草滋補肝腎，涼血止血，與茯苓共為臣藥；川芎活血行氣，祛風止痛，引藥以上行頭目。全方共奏滋補肝腎，培補先天之精血，健脾益氣，以助氣血生化之源[15]。

本研究結果表明不同濃度的杞精明目湯藥物血漿對TSG-6和MMP-1、MMP-3基因的轉錄和蛋白的表達均有調控作用。其中20%和10%濃度的含藥血漿具有上調CCh成纖維細胞表達TSG-6的作用，而5%的含藥血漿對其影響作用不明顯；20%和10%的含藥血漿對MMP-1mRNA轉錄的抑制作用最顯著，其次是5%的含藥血漿；20%的含藥血漿對MMP-1蛋白表達的抑制作用最顯著，而10%和5%濃度對MMP-1蛋白表達的抑制作用差異無統計學意義；三種濃度的含藥血漿對MMP-3均有抑制作用，最顯著的是20%含藥血漿，其次為10%；三種濃度的含藥血漿對CCh成纖維細胞PTX3的表達均無明顯調控作用。與前期基礎研究證實杞精明目湯藥物血漿可以有效抑制MMPs表達，同時能上調TIMPs的表達，促進MMPs和TIMPs之間平衡恢復[14]的結果一致。

松弛結膜堆積在瞼緣內外眥部之間，不僅引起眼表淚液動力學異常，還可導致淚液中炎癥相關蛋白[白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、TNF-α、IL-6和α1酸性糖蛋白（α1-acid glycoprotein, A1AG）、鈣結合蛋白S100-A4、S100-A8等][17-18]凋亡，凋亡調節相關蛋白[19]以及降解酶（MMP-9）[8]等表達亦明顯增加。研究表明炎性細胞因子（TNF-α或IL-1β）可明顯上調結膜松弛癥成纖維細胞MMPs及TSG-6、PTX3的表達[11-13]，同時siRNA干擾下調結膜松弛癥成纖維細胞TSG-6或PTX3基因的表達后，MMP-1、MMP-3的表達及細胞凋亡均明顯增多[12-13]。本研究結果顯示杞精明目湯藥物血漿能夠上調CCh成纖維細胞表達TSG-6，同時抑制MMPs的表達，提示杞精明目湯藥物血漿或能局限炎癥反應作用，恢復局部炎性反應蛋白及抗炎蛋白之間的平衡作用；而杞精明目湯藥物血漿對PTX3的表達影響不明顯，推測原因為TSG-6和PTX3在CCh發病機制中所發揮的作用不一致，PTX3的作用可能不在于炎癥保護方面，或與CCh細胞凋亡有關；這些推論還需進一步研究證實。

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Effects of Qijing M ingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctivochalasis

KE Meiqing,ZHANG Xingru,XIANG Minhong,et al.
Putuo Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai200062,China

OBJECTIVE To investigate the effects ofQijing Mingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctival fibroblastsof conjunctivochalasis(CCh).METHODS Differentconcentration(5%,10%,20%) ofdrug serum or drug free serum were prepared.Conjunctival fibroblastsofCCh were cultured with different concentration of drug serum or drug free serum for 4 or 24 hours before being harvested for total RNAs or proteins,respectively.The expressing levelsofmRNA and proteinsof TSG-6,PTX3,MMP-1 and MMP-3were detected by quantitative real time PCR(real time PCR)and western blot assay.RESULTS The 20%and 10%concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction effectively increased the expression of TSG-6 mRNA and protein,and their effectswere statistically similar(P>0.05);while the concentration of5%medicated serum had no significanteffecton theexpression of TSG-6mRNA and protein.The concentration of20%,10%and 5%medicated serum had no significanteffecton the expression of PTX3mRNA and protein.Three concentrations of drug serum all significantly reduced the expression ofMMP-1mRNA and protein.The inhibition effects of 20%and 10%medicated serum on MMP-1 mRNA were obvious,but of no significant difference (P<0.05),and both greater than it of 5%;Themost dramatic inhibition effect ofmedicated serum on MMP-1 protein was from 20%medicated serum,and there was no significant difference between effects of 10%and 5%concentration(P> 0.05).All three different concentrations of drug serum signifi-cantly reduced the expression of MMP-3 mRNA and protein.Themost obvious inhibitory effect of drug serum on MMP-3mRNA and protein was from 20%,the second effective concentration was 10%.CONCLUSIONS The 20% and 10%drug serum containing QijingMingmu decoction could up-regulate the expression of TSG-6 in fibroblasts of conjunctivochalasis.The three concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction had no significant effecton PTX3 but they could effectively inhibit theexpression ofMMP-1 and MMP-3.

conjunctivochalasis;Qijing Mingmu decoction;tumor necrosis factor alpha stimulated gene 6; pentraxin3

R777.3

A

1002-4379（2017）02-0087-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.005

上海市普陀區高層次人才科研創新資助項目（2014-A-22）；上海市醫學重點專科（ZK2015A20）

上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科，上海200062

張興儒，E-mail：zhangxingru928@163.com