一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒的序列測定和分子特征分析

紀 蕾，吳曉芳，陳莉萍，韓建康

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一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒的序列測定和分子特征分析

紀 蕾，吳曉芳，陳莉萍，韓建康

目的 對湖州地區一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒進行序列測定和分子特征分析。方法 根據GI型諾如病毒保守序列自行設計5對引物，用一步法RT-PCR分段擴增GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，采用生物信息學相關軟件對序列進行整理和分析。結果 CHN/Huzhou/N10全長7 740 bp，編碼區包括3個開放讀碼框架(ORF1～ORF3)，分別長5 400 bp(5～5 404 nt)、 1 632 bp(5 388～7 019 nt)和642 bp(7 019～7 660 nt)。RdRp區，VP1區和VP2區的系統進化分析顯示CHN/Huzhou/N10屬于GI.8基因型。衣殼蛋白區的氨基酸序列分析表明，與原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1區的氨基酸序列共有16個變異位點，12個位于P2區。其中aa347T→S，aa397T→E這2個變異位點分別位于HBGA受體結合袋位點II和III內。結論 本文獲得了我國GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，相關序列信息可用于病毒的遺傳進化研究、快速診斷試劑的研發以及疫苗的設計。

諾如病毒；GI.8；全基因組

急性腹瀉是世界上最常見的疾病之一，也是全球主要的公共衛生問題之一。自從敏感的分子檢測技術的應用以來，諾如病毒(Norovirus，NoV)已被公認為是發達國家和發展中國家急性病毒性腹瀉的重要病原。該病毒常可通過污染的水源和食物引起急性胃腸炎的流行，各年齡人群普遍易感。根據病毒主要衣殼蛋白VP1的核苷酸序列差異，NoV可分為6個基因群(gene group I～VI，GI～GVI)，其中可以引起人類感染包括基因群GI、GII和GIV[1]。在引起急性胃腸炎流行的NoV中，GII型NoV一直處于優勢地位，其中GII.4型是流行的主要基因型別。因此目前國內外有關GII型NoV的分子流行病學研究相對較多，而GI型NoV的序列研究相對較少。湖州地區2008-2009年2起由GI型NoV引起的急性腹瀉疫情中均檢出了GI.8型NoV[2]，我們對檢出的其中一株GI.8型NoV進行測序，以了解其基因結構和遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 標本信息 湖州地區2008年4月某學校一起NoV引起的急性腹瀉疫情中采集的學生糞便標本。該份標本經RT-PCR檢測顯示GI型NoV核酸陽性，RT-PCR引物探針參照文獻[3]，部分衣殼蛋白序列分析顯示為GI.8型NoV[2]。

1.2 病毒核酸提取和基因組擴增 病毒核酸提取采用羅氏公司High Pure Viral RNA Kit。取糞便加入無菌磷酸鹽緩沖液制成15%懸液。混勻后4 500 r/min離心8 min，取200 μL上清參照試劑盒說明書提取核酸。利用5對引物擴增病毒的全基因組序列，其中 9條為參照GenBank上下載的GI型NoV全基因組序列保守區自行設計的引物， 1條用于擴增病毒3′末端的下游引物TX30SXN5則參照已發表文獻[4]。引物序列具體見表1，引物位置參照毒株NV68 (M87661)。采用大連寶生物公司的PrimeScript OneStep RT-PCR kit進行序列的擴增。反應條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 1.5 min； 94 ℃ 45 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，40次循環；72 ℃延伸10 min(其中F1和R1擴增延伸3.5 min，F4和R4擴增延伸1mim)。PCR擴增陽性產物送南京金斯瑞公司進行純化測序。

表1 NoV全基因組擴增引物

Tab.1 Primers used for the full-length genome amplification

引物名稱Primer方向Polarity序列(5′?3′)Sequences(5′?3′)位置PositionF1+GTGAATGATGATGGCGTCGAAA1?22R1-GAGGTAGGGGTTGTGGGGTTGA3629?3650F2+GGNGAAACHGAAATGGAAATCCG3104?3126R2-CTGGGTCAAAWTCTATGTCAGTMGA4886?4910F3+GGAAGAATGATGATTGGAATGGCAC4221?4245R3-CGTCCTTAGACGCCATCATCATTTA5356?5379F4+TAGTCAGGCAACAGGTGGAT4983?5002R4-TGGTAAAGGTTCAGCCGTAT5432?5455F5+AAATGATGATGGCGTCTAAGGACG5356?5379TX30SXN5-GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTPolyA

1.3 序列的遺傳進化分析 利用DNAStar的SeqMan軟件包和MegAlign軟件包對測序結果進行整理及序列的同源性分析。應用MEGA6.0 軟件采用N-J模型進行系統進化分析并構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 病毒基因組結構特征 GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的基因組全長7 740 bp，編碼區包括3個開放讀碼框架(Open reading frames，ORF)。ORF1長5 400 bp(5～5 404 nt)，編碼包含RNA依賴的RNA多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)在內的病毒非結構蛋白；ORF2長1 632 bp(5 388～7 019 nt)， ORF3長642 bp(7 019～7 660 nt)，分別編碼病毒的主要衣殼蛋白VP1和小衣殼蛋白VP2。CHN/Huzhou/N10的序列已上傳GenBank，登錄號為KP407450。

2.2 系統進化分析 從GenBank上下載GI.I～GI.9基因型NoV代表株的序列進行同源比對和分析。核苷酸序列的同源性分析顯示CHN/Huzhou/N10在RdRp區(4 593～5 404 bp)、VP1區(5 388 bp～7 019 bp)和VP2區(7 019 bp～7 660 bp)均與GI.8型代表株的同源性最高(92.8%～99.6%)。分別構建RdRp區，VP1區和VP2區的系統進化樹，結果見圖1。CHN/Huzhou/N10在各區均與GI.8基因型代表株聚為一簇，屬于GI.8基因型，以上結果表明CHN/Huzhou/N10未發生重組。用于序列比對分析的GI型NoV各基因型代表株分別為GI.1_M87661，GI.2_L07418，GI.3_U04469，GI.4_AB042808，GI.5_AB039774，GI.6 _AF093797，GI.7_JN603251(RdRp區)，GI.7_AJ277609(VP1區)，GI.7_ JN899243(VP2區)，GI.8_GU299761(RdRp區)，GI.8_AF538079(VP1區和VP2區)，GI.9_HQ637267。

2.3 衣殼蛋白VP1區的序列分析 CHN/Huzhou/N10 VP1區全長1 629 bp，編碼543個氨基酸。GenBank數據庫上下載已有的GI.8型NoV的VP1全序列，包括GI.8型原型株Boxer/2001/US、Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531和2008890321/2008/US。CHN/Huzhou/N10與原型株Boxer/2001/US衣殼蛋白區的氨基酸同源性為96.9%，與其他3株的氨基酸同源性為99.4%～99.6%。與原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1區的氨基酸序列共有16個變異位點,其中12個位于P2區，占8.5%。在其他區域，變異位點的數量和比例要小的多，分別為N端2個，占4.1%；S區1個，占0.6%；P1區1個，占0.6%，具體見表3。除了第357位的aa357H→R為CHN/Huzhou/N10所特有，其余11個位于P2區的變異位點為Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US和CHN/Huzhou/N10所共有，見圖2。其中aa347T→S，aa397T→E 這2個變異位點分別位于人外周血組織抗原(HBGA)結合位點II和III[5]。

表2 CHN/Huzhou/N10 RdRp、VP1、VP2區的核苷酸序列同源性分析(%)

Tab.2 Nucleotide identity of RdRp，VP1，and VP2 region between2008/Huzhou/N11 and the representatives of GI.1-GI.9 genotypes(%)

GI．IGI．2GI．3GI．4GI．5GI．6GI．7GI．8GI．9RdRp75．776．682．374．075．576．179．199．678．8VP164．564．570．662．963．864．266．792．868．7VP258．556．947．854．756．559．461．893．770．1

A. RdRp 區B. VP1區 C. VP2區圖1 CHN/Huzhou/N10 RdRp區、VP1區、VP2區序列系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analyses based on partial RdRp gene(A)， complete VP1 gene (B) and VP2 gene (C)

表3 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣殼蛋白區氨基酸水平變異位點分析

Tab.3 Variation sites in the capsid protein VP1 of CHN/Huzhou/N10

區域Domainaa位置aapositionaa長度Totallength(aa)變異位點所占比例No．(%)ofinformativeaaN1?49492(4．1)S50?2191701(0．6)P1227?279，420?5431771(0．6)P2280?41914012(8．5)

圖2 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣殼蛋白P2區的變異位點分析Fig.2 Variation sites in the capsid protein P2 region of CHN/Huzhou/N10

3 討 論

NoV基因型別眾多，根據病毒VP1區的核苷酸序列差異，GI型NoV可進一步分為9個基因型(GI.1～GI.9)，其中Boxer/2001/US是GI.8型的原型參考株[6]。此外，作為RNA病毒，NoV易發生變異和重組，這些重組株的RdRp和VP1區基因分屬于不同基因型。目前已發現的GI型NoV重組株包括GI.2/GI.6，GI.d/GI.3等[7-8]。因此全基因組序列的獲得將有助于更全面準確的對病毒進行遺傳進化分析。我們用自行設計的5對引物成功擴增了GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的全基因組序列， RdRp、VP1和VP2區的同源性分析和系統進化結果分析表明CHN/Huzhou/N10為GI.8型，未發生重組現象。

衣殼蛋白VP1作為NoV的主要結構蛋白可以折疊成2個區域，形成內殼的S區(Shell，S)和形成拱樣凸起的P區(Protruding，P)。P區包括P1和P2兩個亞區，分別構成拱樣凸起的基底部和頂部，P2區位于衣殼的最外面，被認為是抗體識別和受體結合的關鍵部位，也是病毒序列最易變異的區域。目前GenBank上已有的GI.8型VP1全序列僅有5條，除了原型株Boxer/2001/US外，其余4條分別來自于2007-2008年中國、日本和美國檢出的GI.8型NoV(Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US、CHN/Huzhou/N10)。此外，文獻表明2008年杭州余杭地區的多起胃腸炎暴發中也曾檢出GI.8型NoV[9]。以上有限的序列信息和文獻報道提示GI.8型NoV在2008年前后在我國及其他國家有一定的流行。進一步VP1區氨基酸序列的分析表明，與原型株Boxer/2001/US相比，2007年以來檢出的GI.8型NoV在P2區有11個共有的變異位點，其中aa347T→S，aa397T→E 這兩個變異位點分別位于HBGA受體結合袋位點II和III內。這些位于P2區的氨基酸變異是否導致病毒抗原性和受體結合模式發生變化，從而影響了病毒的感染與流行，值得進一步研究。

NoV尚無法進行常規的細胞培養，基于分子生物學技術其進行遺傳進化研究是目前認識病毒的重要方法。目前GenBank中唯一的1條GI.8基因組全序列(KJ196298)由日本上傳，本文獲得了我國GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，相關序列信息可用于病毒的遺傳進化研究、快速診斷試劑的研發以及疫苗的設計。

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Complete genome sequence of a genogroup I geno type 8 norovirus identified in Huzhou，China

JI Lei，WU Xiao-fang，CHEN Li-ping，HAN Jian-kang

(HuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention，Huzhou313000，China)

We identified and characterized the full-length genome of a GI.8 norovirus strain CHN/Huzhou/N10 isolated in an outbreak in Huzhou，China. The full-length genome of CHN/Huzhou/N10 was amplified using five pairs of primers which were designed according to the full-length GI norovirus genome sequences published in GenBank database. Multiple alignments were performed using DNAStar，the phylogenetic relationship of CHN/Huzhou/N10 and the representative NoV (Norovirus) strains from each genogroup were assessed using the software MEGA version 6.0. The viral genome of CHN/Huzhou/N10 was 7 740 nucleotides in length，which was consist of three ORFs spanning 5-5 404 nt (ORF1)，5 388-7 019 nt(ORF2)，and 7 019-7 660 nt (ORF3)，respectively. Phylogenetic analysis based on polymerase and capsid sequences VP1 and VP2 region indicated that CHN/Huzhou/N10 belonged to GI.8 genotype. The amino acid sequence analysis of the VP1 region showed that CHN/Huzhou/N10 had 16 mutations compared with the representative strain Boxer/2001/US，12 of these variations were located in the P2 subregion. Moreover，a single amino acid change (T347S) occurred at histo-blood group antigen (HBGA) binding site II and another single amino acid change (T397E) occurred at HBGA binding site III. In this study，the first full genome of norovirus GI.8 isolated in Huzhou，China was extensively characterized. The data would be helpful not only for the epidemiology study，but also for the diagnostic tool development and effective vaccine design in the future.

norovirus; GI.8; complete genome

湖州疾病預防控制中心，湖州 313000 Email: jileichn@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.008

R373.2

A

1002-2694(2017)07-0613-04

2016-11-16 編輯：張智芳