海藻糖合成酶結構和功能的研究進展

王東生，耿 強，周家海，江 凌*，黃 和

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009；2.南京工業大學食品與輕工學院，江蘇 南京 210009；3.中國科學院上海有機化學研究所 生命有機化學國家重點實驗室，上海 200032；4.南京工業大學藥學院，江蘇 南京 210009)

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海藻糖合成酶結構和功能的研究進展

王東生1，耿 強2，周家海3，江 凌2*，黃 和4

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009；2.南京工業大學食品與輕工學院，江蘇 南京 210009；3.中國科學院上海有機化學研究所 生命有機化學國家重點實驗室，上海 200032；4.南京工業大學藥學院，江蘇 南京 210009)

海藻糖合成酶能夠以麥芽糖為底物，通過分子內轉糖基作用，一步催化反應生成海藻糖。綜述了國內外海藻糖合成酶結構和功能的最新研究進展，列舉了已經被克隆和表達的海藻糖合成酶及其酶學性質，總結和比較了幾種已被解析的海藻糖合成酶的結構和催化機理，指出了海藻糖合成酶的深入研究對海藻糖工業化生產的重要意義。

海藻糖合成酶；晶體結構；催化機制

海藻糖合成酶(trehalose synthase，簡稱TreS)能夠以麥芽糖為底物，催化分子內轉糖基作用生成海藻糖，即將麥芽糖的α,α-1,4-糖苷鍵轉變為海藻糖的α,α-1,1-糖苷鍵。通過對不同來源TreS序列同源性分析發現，TreS是糖基水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13，簡稱GH13)成員之一[1]。Tsusaki等[2]將其列為GH13的16亞族(GH13-16 subfamily，麥芽糖葡萄糖基轉移酶亞族)和33亞族(GH13-33 subfamily，TreS亞族)。

由于海藻糖的特殊性質，一般不能通過化學方法合成，大多采用生物法合成。目前，工業上常用酶催化、微生物抽提和發酵這3種方法大規模生產海藻糖[3]。但由于微生物抽提法工藝復雜、生產成本高，發酵法轉化率低、發酵副產物多、提取精制困難等，因此這兩種方法都不適于海藻糖的大規模工業化生產。通過酶催化生產海藻糖，產物成分明確，分離工藝相對簡單，可有效提高海藻糖得率。目前，酶催化生產海藻糖的途徑主要有5種[4]，其中TreS法生產路線最為簡單，TreS以麥芽糖為底物一步催化生成海藻糖。這種方法的關鍵在于TreS需具有高轉化率和強的溫度、pH值耐受性。但是TreS法也存在轉化率低，溫度、pH耐受性差，副產物得率高等缺點[1]。

通過對酶催化機理的深入了解可對酶分子的改造做出理性指導。因此，對TreS催化機理的深入研究十分重要。作者綜述了近年來關于TreS結構和功能的研究進展，總結了TreS的結構特點和部分已知的催化機理。

1 海藻糖合成酶的酶學性質

1996年，Nishimoto等[5-6]率先從脂肪桿菌(Pimelo-bactersp.R48)和水生棲熱菌(ThermusaquaticusATCC33923)中分離得到了TreS，并初步研究了其酶學特性。此后，更多不同來源的TreS被異源表達。來源于不同菌的TreS的基本性質見表1。

表1不同來源的TreS信息統計

Tab.1 The information statistics of trehalose synthase from various bacteria

由表1可以發現，從基因的大小來看，來自嗜熱菌的TreS基因的核苷酸數在2 800個左右，而來自常溫菌的TreS基因的核苷酸只有1 800個左右。而且分子量大小與TreS的性質有直接的關系。一般而言，分子量相對較大的TreS最適反應溫度都在45 ℃以上，分子量小的TreS通常在20～35 ℃之間。

TreS在溶液中呈活性狀態時，通常都是以多聚體的形式存在。來源于彎曲高溫單孢菌(Thermomonosporacurvata)的TreS在活性狀態下是由3個大小為60 kDa的單體組成的同源三聚體蛋白[4]；來源于嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)的TreS在活性狀態下是由4個大小為61 kDa的單體組成的同源四聚體蛋白[25]；來源于恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的TreS在活性狀態下是由6個大小約為400 kDa的單體組成的同源六聚體蛋白[11]；Wang等[26]發現來源于抗輻射奇異球菌(Deinococcusradiodurans)的TreS在活性狀態下是分子量約為120 kDa的同源二聚體蛋白；Roy等[27]發現來源于結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的TreS在活性狀態下是同源四聚體蛋白。雖然不同TreS在活性狀態下的聚合形式、單體分子量大小都不一樣，但是它們的生物學功能都是一樣的。

2 海藻糖合成酶結構研究進展

2.1 TreS已解析結構統計

目前，已經有來源于3種不同菌株分別包括母體、突變體和復合物的TreS結構，通過X-射線衍射法被解析出來，已解析出的TreS結構的基本信息統計見表2。

表2 TreS結構信息統計

Tab.2 The information statistics of trehalose synthase structure

注：*括號內數值為最高分辨率殼層的數據。

2.2 TreS的結構特點

已解析出的TreS結構，從宏觀上主要被分為4個部分，分別命名為結構域A、B、C、D(圖1)。正如GH13家族其它的酶一樣，每個TreS單體主要包括一個catalytic(β/α)8barrel組成的結構域D，一個C-terminalsandwich (大約有90個氨基酸殘基)組成的結構域C[16,26]。結構域D是由(β/α)8barrel組成的核心區域，TreS的活性中心就在這塊區域中[16,26]；結構域 C是由2個反向平行的β-sheets和2個β-strands組成的，這個區域通過一個由氫鍵和疏水作用力形成的廣泛的相互作用網絡緊緊地與(β/α)8barrel連接。結構域C相對來說有其特色，例如：DrTS和MtTS有50%的序列相似性，但它們在結構域C僅有25%的序列相似性[26]。

圖1 TreS的晶體結構Fig.1 Crystal structure of trehalose synthase

另外兩個結構域的形成是通過TreS結構內部α螺旋、β折疊等和(β/α)8barrel之間的擠壓盤繞形成的，它們分別被稱為結構域A和B。這兩個結構域都是loop-rich結構，因此結構柔性相對較大。結構域A(大約含有80個氨基酸殘基)與GH13家族的酶一樣，由一個短的α螺旋和2個或3個反向平行的β-strands[16,26]組成。結構域A與(β/α)8barrel有著強烈的相互作用，它們之間能夠形成10～20個氫鍵和大量的疏水作用力。另一方面，結構域B在TreS中是比較特別的，其中包括一個短的α螺旋，除α螺旋外其它部分沒有表現出明顯的二級結構，呈無規則的loop狀態。結構域D不但包括(β/α)8barrel還包括一個催化區域，催化區域的組成包括催化三聯體Asp-Glu-Asp 和許多保守的底物結合殘基[26,28]。結構域B和C與二聚體的形成有關。結構域A中的一部分loop區域對于活性部位的敞開和閉合充當了一個可開關的“門”的作用[26]。

另外，GH13家族的許多酶都包含金屬離子，Kobayashi等[29]發現金屬離子的參與可能涉及到維持酶的結構穩定，而且已經發現來源于人類腸道菌Bacteroidesthetaiotaomicron的α-淀粉酶和MsTS都存在一個鎂離子和一個鈣離子[30]。例如：Wang等[26]在DrTS中發現有兩個相似的可以結合鎂離子的位點，鎂離子的結合位點包括Asp24、Asp26、Asp28、Asp32的側鏈和Lys30的主鏈O原子，形成了這樣一個序列DXNXDGXGD。在一些其它的GH13家族成員中同樣發現了這樣一個位置，例如在Rhizobiumsp.中的MX-5Sucrose isomerase和酵母中的isomaltase就有相似的鈣離子結合部位[31-32]。另一方面，鈣離子的結合部位會被結合位點上的部分氨基酸殘基(Asn、Asp、Glu、Tyr、Leu)調整。許多α-淀粉酶都有一個相似的鈣離子結合位點，這個位點都會有一個保守的Asp殘基[33]。

2.3 TreS底物結合及構象的變化

根據部分已解析的GH13家族酶的晶體結構發現：底物結合模塊插入到(β/α)8barrel中，其移動可以覆蓋甚至封閉活性部位的入口[26]。雖然NpAS的結構與XaSH的序列一致性只有36%，但當它們結合Tris、葡萄糖、蔗糖和麥芽七糖時，卻能夠表現出一個相似的構象[34]。然而，Skov等[35]發現apoD.radioduransAS(DrAS)表現出了一個顯著不同的構象，它有著一個更加開放的活性位點。此外，Ravaud等[31]發現RhSI結合Tris、葡萄糖、蔗糖和抑制劑時，表現出了一個相似的封閉結構，ScIM的晶體結構也表現出了一個幾乎封閉的構象，其底物與活性位點的結合機制目前還不清楚[32]。由于ScIM與RhSI有38%的序列一致性和高的結構同源性，推測它們形成這樣的封閉構象有可能跟結構域A和底物結合模塊有關，特別是結構域A和(β/α)8barrel中靠近活性中心的兩段loop，這兩段loop可能涉及到活性位點的開與關[26]。

Wang等[26]通過結構比對發現，DrTS、MsTS和MtTS的晶體結構顯示出不同酶的結構差異，主要是結構域之間的相對方向不同。但是在XaS-sucrose、NpAS-maltoheptaose和DrTS-Tris的復合物結構中結構域A的相對方向是一致的，特別是在活性中心正上方的一段loop都有著一個相似的空間位置，而且apo XcSH、apo DrAS、MsTS和MtTS的結構域A也有一個相似的走向，可能是因為TreS與這些酶有較高的結構同源性，特別是相似的活性部位和結構域A。

在GH13家族的很多酶中已經證實，Tris作為一個競爭性抑制劑能夠抑制蔗糖與TreS的結合[31,34]，其抑制效果也已經被證實[1,17]。例如Wang等[26]在DrTS-Tris復合物中發現，活性中心附近的殘基之間形成鹽橋和氫鍵封閉了活性中心的入口，結構域A中的3個氨基酸(Ile150、Phe151、Phe173)和S7中的4個氨基酸(His318、Asp319、Glu320、Glu324)都構成活性口袋的一部分[26]，這意味著底物與這些殘基的相互作用將會使這兩個子域相互靠近形成一個關閉的構象。Wang等還證明了DrTS野生型和N253A突變體的晶體結構除了Glu324的側鏈走向外基本上是完全相同的。在N253A突變體中，Asn253和Glu324相互作用的破裂導致Glu324側鏈的移動，其側鏈的移動是為了給活性中心創造一個小的溶劑進入的孔洞。這就是N253A突變體有約11%的異構酶活性和約180%的水解活性的原因。與N253A相似，R148A突變體表現為約12%的異構酶活性和約150%的水解活性，這表明當148位的Arg被Ala代替時，也有可能形成了一個小的可以讓水分子進入的孔洞[26]。

2.4 TreS與小分子復合物結構

Roy等[27]解析出了M.tuberculosisTreS的晶體結構。通過超速離心分析方法得知此酶在溶液中是形成四聚體，通過X-ray小角散射發現，TreS連同Pep2形成了一個異八聚體的絡合物，而且Roy等證明了這個絡合物的形成能夠顯著地提高Pep2的麥芽激酶的活性，此絡合物的生成可能在糖基轉移酶GlgE途徑中充當一個調控機制，它的存在能夠避免代謝途徑中中間產物毒素的積累。

Pan等[36]發現TreS表現出α-淀粉酶的活性，能被α-葡糖苷酶的抑制劑阿卡波糖有效地競爭性抑制。Cancer等[16]獲得了分辨率為1.84 ?的TreS-acarbose復合物結構，出人意料的是，阿卡波糖并沒有結合在TreS的活性部位上，而是結合在了離TreS活性部位大約40 ?遠的一個界限清晰的表面口袋上(圖2a)，阿卡波糖形成一個彎曲的構象(圖2b)。在結合部位內有一個由Trp476、 Met480、 Phe577、Trp579這幾個氨基酸構成的一個疏水區域負責與阿卡波糖的結合。Laskowski等[37]分析表明，結合口袋是由位于C端結構域與(β/α)8barrel中的1個α螺旋之間相鄰的13個氨基酸殘基組成的，而且配體在連接時形成了6個氫鍵。另外，蛋白結合界面覆蓋面積為505 ?2，或者說是覆蓋面積占了阿卡波糖分子總面積的63%。通過這個復合物結構的獲得也說明了以前的一些猜測：許多GH13家族成員都有這樣一個區域作為碳水化合物結合模塊。事實上，在糖苷水解酶中這種輔助的模塊對于碳水化合物的連接是非常常見的[38]。

a.阿卡波糖與TreS的結合位點離活性中心有40 ?的距離 b.阿卡波糖與TreS結合部位的詳細結構

3 海藻糖合成酶催化作用機理研究進展

TreS屬于糖基水解酶GH13家族，一個典型的(β/α)8桶狀催化結構域是該家族酶共有的結構特征[39]，研究者幾乎一致認為它們的催化機制是相似的。

Nishimoto等[9]證明TreS以麥芽糖為底物催化生成海藻糖的過程不是分子間的反應，而是一個分子內的兩個單糖的重排過程。Koh[40]用放射性同位素標記的方法，通過分析反應物和不同產物的組成，進一步說明了TreS催化的反應是一種分子內的轉糖基反應。在酶分子內先是麥芽糖的α-1,4-糖苷鍵斷裂生成葡萄糖和葡萄糖基，然后再形成α-1,1-糖苷鍵，從而生成海藻糖，而在第二步水分子作為親和試劑攻擊葡萄糖基時會生成副產物葡萄糖。Wang等[26]在研究DrTS時發現，此酶狹窄且封閉的活性中心區域能夠在水中保護葡萄糖基酶中間物不被水解，而且為了完成分子內異構化反應會在活性位點把雙糖分解為葡萄糖或果糖，最后重新攻擊共價的中間物。

Chen等[14]研究來自P.torridus的TreS時發現His106、Asp203、Glu245、His310、Asp311等5個氨基酸殘基與酶的催化活性緊密相關。通過氨基酸序列比對發現，這5個氨基酸在TreS和部分GH13家族酶中是高度保守的，如分別來自T.curvata、M.smegmatis、D.radiodurans、Pimelobactersp.R48、T.Aquaticus等的TreS。當把這5個氨基酸分別突變后，突變體酶活幾乎完全喪失。Zhang等[28]通過分析研究來自M.smegmatis的TreS機制，發現其與糖基水解酶家族有著一個相似的兩步雙取代機制(two-step,double-displacement mechanism)，并發現在M.smegmatis中與上述相同的5個保守氨基酸中，Asp230是作為催化親核試劑(catalytic nucleophile)，Glu272是常規的酸/堿催化(general acid/base catalyst)，His341和Asp342是保守的氨基酸(conserved carboxylic acid)。

4 展望

通過TreS生產海藻糖是當前海藻糖工業化生產的有效且廉價的途徑。由于TreS生產海藻糖所體現出來的優勢，以及TreS本身性質的部分缺陷，最近幾年對該酶的結構和功能的研究逐漸深入。目前，TreS的結構和功能的研究已經取得了一定的進展和成果，但還有諸多問題有待于解決，如在酶的反應過程中糖苷鍵的斷裂和生成的具體機制還有待確定等。我們相信，隨著對TreS結構的了解和研究的逐漸深入，對此酶作用機制的詳盡闡明，將為該酶的后續改造提供理論基礎，以期達到提高酶的熱穩定性、提高海藻糖的轉化率和降低副產物葡萄糖得率的目的，從而為TreS的工業化應用創造更好的條件。

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Research Progress in Structure and Function of Trehalose Synthase

WANG Dong-sheng1，GENG Qiang2，ZHOU Jia-hai3，JIANG Ling2*，HUANG He4

(1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China；2.CollegeofFoodScienceandLightIndustry，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China；3.StateKeyLaboratoryofBioorganicandNaturalProductsChemistry，ShanghaiInstituteofOrganicChemistry，ChineseAcademyofSciences，Shanghai200032，China；4.CollegeofPharmacy，NanjingTechUniversity，Nanjing210009，China)

Trehalose synthase can catalyze maltose into trehalose in one step by intermolecular transglycosylation.We summarized the latest research progress of structure and function of trehalose synthase,and enumerated trehalose synthase which had been cloned and expressed,and their enzymatic properties.We also summarized and compared the structures and catalytic mechanisms of several trehalose synthases which had been resolved,and pointed out the importance of in-depth study of trehalose synthase to the industrial production of trehalose.

trehalose synthase；crystal structure；catalytic mechanism

中國科學院上海生命有機化學國家重點實驗室開放基金項目(SKLBNPC15429)，國家自然科學基金青年基金項目(21506101)，國家自然科學基金聯合基金項目(U1603112)，江蘇省第十二批六大人才高峰計劃項目(2015-JY-009)，2016年度省級環保科研課題(2015053)

2017-03-08

王東生(1996-)，男，安徽亳州人，碩士研究生，研究方向：發酵工程和酶工程；通訊作者：江凌，博士，副教授，E-mail：jiangling@njtech.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.002

Q784

A

1672-5425(2017)07-0006-06

王東生，耿強，周家海，等.海藻糖合成酶結構和功能的研究進展[J].化學與生物工程，2017，34(7)：6-11，16.