白藜蘆醇與吉非替尼的協同抗肺癌作用及機制研究

張紅萍 袁梅

白藜蘆醇與吉非替尼的協同抗肺癌作用及機制研究

張紅萍 袁梅

目的探討白藜蘆醇是否能提高吉非替尼對肺癌細胞的殺傷活性并研究其機制。方法MTT法檢測人非小細胞肺癌細胞系PC9細胞在低濃度吉非替尼和白藜蘆醇處理下的細胞活力。Western blot實驗檢測低濃度吉非替尼和白藜蘆醇對PC9細胞c-met表達水平，表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）磷酸化水平及caspases活化水平。流式細胞術檢測PC9細胞在低濃度吉非替尼和白藜蘆醇處理下的凋亡率。結果低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇對PC9的細胞活力抑制率顯著高于低濃度吉非替尼組和白藜蘆醇組[（57.7±3.3）%比（12.4±1.1）%、（8.6±0.8）%，P＜0.05]。白藜蘆醇處理可誘導PC9細胞c-met蛋白的下調并顯著增強低濃度吉非替尼對PC9細胞PI3K和AKT磷酸化水平的抑制作用。低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇組對PC9細胞活力的抑制率和凋亡誘導率顯著高于低濃度吉非替尼組和低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質粒組[抑制率：（57.7±3.3）%比（12.4±1.1）%、（16.3±1.3）%，P＜0.05；凋亡率：（30.9±1.8）%比（7.2±0.5）%、（10.6±0.8）%，P＜0.05]。低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇組對PC9細胞caspase-9及caspase-3的活化顯著強于低濃度吉非替尼組和低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質粒組。結論白藜蘆醇可能通過下調c-met的表達提高肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。

非小細胞肺癌細胞；PC9細胞；白藜蘆醇；c-met；PI3K/AKT；吉非替尼

非小細胞肺癌是一種發病率和死亡率都非常高的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康[1]。化療是肺癌治療的常規方法，但其嚴重的毒副作用卻限制了其應用[2]。因此針對肺癌腫瘤細胞的靶向治療更能被患者所接受。吉非替尼屬于一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，對正常細胞的副作用很小而對肺癌細胞有很好的靶向性，因此吉非替尼現已作為一線藥物廣泛應用于非小細胞肺癌的治療[3]。然而隨著吉非替尼的持續使用，肺癌細胞對吉非替尼的敏感性會逐漸降低[4]。因此通過輔助治療藥物提高肺癌細胞對吉非替尼的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究探討天然藥物白藜蘆醇是否能提高吉非替尼對肺癌細胞的殺傷活性并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料吉非替尼、白藜蘆醇、噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bro mide，MTT）和凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養基購于美國Gibco。c-met、磷酸化表皮生長因子受體（EGFR）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）、活化半胱天冬酶-9（caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（caspase-3）和β-肌動蛋白（β-actin）兔抗人抗體購于美國Cell Signaling。ECL試劑盒（增強化學發光法試劑盒）購于美國Pierce。pcDNA3.1和Lipofectamine2000（脂質體2000）購于美國Invitrogen。

1.2 細胞培養人非小細胞肺癌細胞系PC9細胞購于美國ATCC。腫瘤細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。

1.3 c-met重組質粒構建和轉染將c-met基因cDNA全長序列（Gene ID：NM_001324401）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成c-met重組真核表達質粒[5]。使用Lipofectamine2000按照試劑說明書操作將2μg/mL c-met質粒轉染入PC9細胞中。

1.4 細胞活力抑制率測定將PC9細胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜。將細胞用c-met質粒進行轉染。24h后用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L的吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細胞48h，之后加入20mLMTT（5mg/mL）37°C恒溫培養箱中培養4h，移除孔內培養基，加入100μL二甲亞砜，570nm波長下測定OD值。分組情況及各組藥物濃度見表1。細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.5 Western blot實驗將PC9細胞按5×105/孔接種在6孔板上孵育過夜。將細胞用c-met質粒進行轉染。24h后用0.01μmol/L吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細胞48h。之后用蛋白提取液提取腫瘤細胞中的總蛋白質。將等量的總蛋白質用12% SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用c-met、磷酸化EGFR、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-9、活化caspase-3和β-actin。兔抗人抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.6 細胞凋亡實驗將PC9細胞按5×105/孔接種在6孔板上孵育過夜。將細胞用c-met質粒進行轉染。24h后用0.01μmol/L吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細胞48h。之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin-V陽性細胞即為凋亡細胞。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對吉非替尼的協同抗肺癌作用MTT實驗結果顯示，吉非替尼對PC9細胞的殺傷活性呈劑量依賴性，0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L的吉非替尼對PC9細胞的細胞活力抑制率分別為0、（12.4±1.1）%、（28.5±1.9）%、（42.2±2.8）%、（56.9± 3.2）%、（67.5±3.9）%。低濃度吉非替尼（0.01μmol/L）和10μmol/L白藜蘆醇單獨治療，對PC9細胞的殺傷活性較弱，兩者聯合后能顯著誘導PC9細胞發生死亡（P＜0.05），見表1。

表1 白藜蘆醇增強低濃度吉非替尼對PC9細胞的殺傷活性（）

表1 白藜蘆醇增強低濃度吉非替尼對PC9細胞的殺傷活性（）

注：與低濃度吉非替尼組比較，#P＜0.05；與白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組比較，*P＜0.05

組別對照組低濃度吉非替尼組白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質粒組孔數3 3 3 3 3吉非替尼濃度（μmol/L）0 0.01 0 0.01 0.01白藜蘆醇濃度（μmol/L）0 0 1 0 10 10細胞活力抑制率（%）0 12.4±1.1 8.6±0.8 57.7±3.3#△16.3±1.3*

2.2 白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PI3K/AKT途徑的抑制作用Western blot實驗結果顯示，白藜蘆醇能顯著抑制PC9細胞c-met的表達，而低濃度吉非替尼單獨治療雖能顯著抑制表皮生長因子受體（EGFR）的磷酸化，但對PI3K/ AKT磷酸化抑制作用較弱（圖1）。然而低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇后，PC9細胞的PI3K/AKT磷酸化受到顯著抑制（圖1），提示白藜蘆醇能增強吉非替尼對PI3K/AKT途徑的抑制作用。當轉染c-met表達質粒后，低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇對PI3K/ AKT途徑的抑制作用顯著降低（圖1），表明白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PI3K/AKT途徑的抑制作用。MTT實驗結果顯示低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質粒組的PC9細胞活力顯著低于低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組（P＜0.05），表明白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PC9肺癌細胞的殺傷活性，見表1。

2.3 低濃度吉非替尼聯合白藜蘆醇顯著誘導PC9細胞發生caspases依賴的凋亡流式細胞實驗結果顯示，白藜蘆醇能顯著提高低濃度吉非替尼對PC9細胞的凋亡誘導率（P＜0.05），而轉染c-met質粒能顯著抑制兩者聯合對PC9細胞的凋亡誘導效應（P＜0.05），見表2。Western blot實驗結果顯示，白藜蘆醇能顯著促進低濃度吉非替尼對PC9細胞caspase-9和caspase-3的活化（圖2）。表明白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達促進低濃度吉非替尼對PC9細胞凋亡的誘導和caspases的活化。

3 討論

白藜蘆醇是一種有很強藥理活性的天然多酚類物質，對多種疾病均有良好的治療效果。近期研究表明，白藜蘆醇還有十分良好的抗腫瘤效應，如白藜蘆醇可抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移[6]，還可通過ROS途徑誘導卵巢癌細胞的死亡[7]。另外，白藜蘆醇聯合雷帕霉素還可有效治療膀胱癌[8]。這些研究都證明白藜蘆醇對腫瘤有很好的的輔助治療作用，有良好的應用前景。本研究發現白藜蘆醇能顯著增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性，使低劑量的吉非替尼亦能發揮強大的殺傷腫瘤細胞的生物活性，證明白藜蘆醇與吉非替尼存在協同抗肺癌活性。

圖1 白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PI3K/AKT途徑的抑制作用

圖2 白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對caspase-9和caspase-3的活化

文獻報道，非小細胞肺癌腫瘤細胞表面的表皮生長因子受體（EGFR）會發生過表達或突變。吉非替尼等表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKIs）對這些EGFR突變型的肺癌細胞（如PC9細胞）有很好的靶向性和殺傷活性，因此吉非替尼是目前治療非小細胞肺癌的一線藥物[9]。在EGFR信號通路中，活化的EGFR能導致PI3K及其下游分子AKT的磷酸化使之發生活化。腫瘤細胞中AKT的持續活化又能通過激活下游分子促進細胞的增殖和存活，同時抑制凋亡的發生，因此吉非替尼通過抑制EGFR/ PI3K/AKT通路發揮對肺癌細胞的殺傷作用[10]。然而腫瘤細胞中的PI3K/AKT通路除了受EGFR調控外，還受肝細胞生長因子受體c-met的調節。高表達的c-met能激活腫瘤細胞中包括PI3K/AKT在內的多種促進腫瘤存活和生長的信號通路[11-12]。因此，c-met途徑是誘導肺癌細胞產生對吉非替尼獲得性耐藥的重要機制，過表達的c-met同樣能顯著激活PI3K/ AKT通路而不依賴于EGFR的活化[13]。

表2 白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PC9細胞凋亡的誘導（）

表2 白藜蘆醇通過下調c-met蛋白的表達增強吉非替尼對PC9細胞凋亡的誘導（）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與低濃度吉非替尼組比較，#P＜0.05；與白藜蘆醇組比較，&P＜0.05；與低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組比較，*P＜0.05

組別對照組低濃度吉非替尼組白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質粒組孔數3 3 3 3 3吉非替尼濃度（μmol/L）0 0.01 0 0.01 0.01白藜蘆醇濃度（μmol/L）0 0 1 0 10 10 c-met質粒濃度（μg/mL）0 0 0 0 2細胞凋亡率（%）1.5±0.3 7.2±0.5△4.8±0.4 30.9±1.8#&10.6±0.8*

本研究結果顯示，低劑量的吉非替尼雖然能抑制PC9肺癌細胞的EGFR信號，但卻不能抑制這些細胞中PI3K/AKT的活化。當用白藜蘆醇對肺癌細胞進行處理后，細胞中c-met的表達水平顯著降低，使c-met/PI3K/AKT通路受到抑制，從而使肺癌細胞中PI3K/AKT的活化恢復對EGFR信號的依賴性。因此，當用白藜蘆醇和吉非替尼對肺癌細胞進行聯合治療時，腫瘤細胞的PI3K/AKT受到顯著抑制，進而誘導腫瘤干細胞發生caspases的活化和凋亡的發生。

本研究結果顯示，白藜蘆醇能顯著提高非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的敏感性，增強吉非替尼的抗腫瘤活性。通過機制研究發現白藜蘆醇通過抑制c-met的表達使肺癌細胞中的PI3K/AKT通路恢復對EGFR信號的依賴性。這些研究為吉非替尼等EGFR/TKIs的治療增效提供了新的策略和思路。

［1］S iegel R，Nai s ha d ha m D，Je m al A.Can c e r st a t i st i cs，2013［J］. CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］H ei st RS.F i rst-L ine Syst e m i c The r a py f o r Non-Sm all Cell Lung Cancer［J］.Hematol Oncol Clin North Am，2017，31（1）：59-70.

［3］Ming u e t J，Sm i t h KH，B r a m lage P.Ta r ge t e d t he r a p ie s f o r treatment of non-small cell lung cancer-Recent advances and future perspectives［J］.Int J Cancer，2016，138（11）：2549-2561.

［4］K o b a y a s hi I，Ta k aha s hi F，Ta k aha s hi K，e t al.O ct4 p la ys a crucial role in the maintenance of gefitinib-resistant lung cancer stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2016，473（1）：125-132.

［5］Zh u C，L i Y，G ao R，e t al.G ene tr an sf e r o f c-m e t c on f e rs protection against D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced acute liver failure［J］.Dig Dis Sci，2012，57（4）：925-934.

［6］D u Z，Zho u F，Hu ang P，e t al.The he d gehog/G li-1 s ig naling pathways is involved in the inhibitory effect of resveratrol on human colorectal cancer HCT116 cells［J］.Iran J Basic Med Sci，2016，19（11）：1171-1176.

［7］S eino M，O k a d a M，K i t ana k a C，e t al.D i ff e r en t ial c on tr i bution of ROS to resveratrol-induced cell death and loss of selfrenewal capacity of ovarian cancer stem cells［J］.Anticancer Res，2015，35（1）：85-96.

［8］A la y e v A，S ala m on RS，H ol z M K，e t al.Co m b ina t ion o f Rapamycin and Resveratrol for Treatment of Bladder Cancer［J］.J Cell Physiol，2017，232（2）：436-446.

［9］Tan C S，G illigan D，P a c e y S.T r ea tm en t a ppr oa c he s f o r EGFR-inhibitor-resistant patients with non-small-cell lung cancer［J］.Lancet Oncol，2015，16（9）：e447-e459.

［10］Fr e ud l sp e r ge r C，B ur ne tt J R，Van Wae s C，e t al.EGFRPI3K-AKT-mTOR Signaling in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas-Attractive Targets for Molecular-Oriented Therapy［J］.Expert Opin Ther Targets，2011，15（1）：63-74.

［11］Y ao Y，D o u C，L i u Q，e t al.M A CC1 suppr e ss e s c ell apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting the HGF/c-MET/AKT pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（3）：983-996.

［12］T r o v a t o M，To rr e M L，Cannavò S，e t al.HGF/c-m e t system targeting PI3K/AKT and STAT3/phosphorylated-STAT3 pathways in pituitary adenomas：an immunohistochemical characterization in view of targeted therapies［J］.Endocrine，2013，44（3）：735-743.

［13］O z a s a H，O g ur i T，Nii m i A，e t al.S igni f i c an c e o f c-M E T overexpression in cytotoxic anticancer drug-resistant smallcell lung cancer cells［J］.Cancer Sci，2014，105（8）：1032-1039.

（收稿：2016-12-12修回：2017-02-18）

Synergistic Effects between Resveratrol and Gefitinib on Lung Cancer

ZHANG Hongping,YUAN Mei.Clinical Laboratory,Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiaxing(314001),China

Objective To investigate the role of resveratrol in increasing the sensitivity of lung cancer cells to gefitinib and the underlying mechanisms.Methods MTT assay was performed to evaluate the viability of PC9 cells treated with resveratrol and low dose of gefitinib.Western blot was used to detect the expression of c-met, phosphorylation of EGFR,PI3K and AKT and activation of caspases on PC9 cells treated with resveratrol and low dose of gefitinib.Flow cytometry analysis was carried out to measure the apoptotic rate of PC9 cells treated with resveratrol and low-dose of gefitinib.Results Cell viability inhibitory rate of PC9 cells in low-dose gefitinib plus resveratrol was significantly higher than the low-dose gefitinib group and resveratrol group（57.7%±3.3%vs 12.4%± 1.1%,8.6%±0.8%,P＜0.05）.Treatment with resveratrol significantly downregulated the expression of c-met as well as enhancing the inhibition of PI3K and AKT phosphorylation induced by gefitinib.Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of PC9 cells in low-dose gefitinib plus resveratrol group was significantly higher than that in the low-dose gefitinib group and the low-dose gefitinib+resveratrol+c-met plasmid group（inhibitory rate:57.7%±3.3%vs 12.4%±1.1%,16.3%±1.3%;apoptotic rate:30.9%±1.8%vs 7.2%±0.5%,10.6%±0.8%;P＜0.05）.Activation of caspase-9 and caspase-3 in the low-dose gefitinib plus resveratrol group was more remarkable than that in the lowdose gefitinib group and the low-dose gefitinib+resveratrol+c-met plasmid group in PC9.Conclusion Resveratrol can increase the sensitivity of lung cancer cells to gefitinib by downregulating the expression of c-met.

non-small cell lung cancer cells;PC9 cells;resveratrol;c-met;PI3K/AKT;gefitinib

浙江省嘉興市中醫院檢驗科（嘉興314001）

張紅萍，Tel：13732569210；E-mail：jxyuanhongping@163.com