跑臺運動對阿霉素聯合醋酸戈舍瑞林誘導骨質疏松大鼠骨密度和骨代謝的影響

蘇紅燕 馬濤

1. 山東體育學院, 山東 濟南 250102 2. 齊魯師范學院，山東 濟南 250200

多柔比星[商品名：阿霉素(doxorubicin，DOX)]是一種被用作有效治療各種癌癥的蒽環類抗生素。雖然應用DOX治療癌癥會產生眾多的副作用和不良反應，但臨床上最引起人們關注的是DOX可造成卵巢的損害，從而導致不育，并且這種損害是不可逆的[1,2]。如果在癌癥患者DOX給藥之前，先給予患者促性腺激素釋放激素(gonadtropin releasing hormone，GnRH)類似物醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate，GA)等藥物，則可以最大限度地降低DOX引起的卵巢損害。GA通過抑制卵巢功能，并進而降低卵巢對DOX引起的傷害的易感性[3,4]。 終止DOX治療后，GA給藥也應當及時終止，之后卵巢功能即可恢復到正常狀態[5]。

對于接受GA或者DOX治療的患者來說，一個重要的威脅是GA和DOX均可導致骨質流失，并進而造成骨質疏松癥的發生。既然單獨使用GA或DOX均可對骨代謝產生不良的影響[6,7]，那么聯合使用GA和DOX是否有可能比單獨使用GA或DOX對骨代謝產生更大的負面影響呢？然而，到目前為止，沒有查到關于GA和DOX聯合作用對骨代謝影響的報道，因此，本研究的目的之一在于研究GA和DOX聯合作用對骨代謝的影響是否顯著大于GA或DOX單獨作用對骨代謝的影響，本研究的目的之二在于研究跑臺運動對DOX聯合GA誘導的大鼠骨質流失的防治效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雌性SD大鼠64只，體重218.07±9.26 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2007-0005]。在標準的實驗室環境下分籠飼養，環境溫度為22±1 ℃，光照遵循12 h:12 h明暗周期，每日提供足夠食物，自由飲水。動物購回適應本實驗室環境和飲食1周后，被隨機分為8組，每組8只：安靜對照組(SED)、DOX干預組(SED+DOX)、GA干預組(SED+GA)、DOX和GA聯合干預組(SED+DOX+GA)、跑臺運動對照組(EX)、跑臺運動結合DOX干預組(EX+DOX)、跑臺運動結合GA干預組(EX+GA)、跑臺運動結合DOX和GA聯合干預組(EX+DOX+GA)。

1.2 藥物干預方案

GA的給藥方式為在跑臺訓練第1天和第29天分別給大鼠頸背部皮下注射諾雷得(GA緩釋植入劑，英國阿斯利康制藥公司)1支(3.6 mg/支)，因為據Furr報道[8]一次性注射3.6 mg的諾雷得可以維持大鼠雌激素分泌降低持續28 d左右，其余組別大鼠同一日頸背部皮下注射等量的可生物降解的硅膠作為對照。DOX的給藥方式[9]為在跑臺訓練第15天開始，每天給予大鼠腹腔注射1.5 mg/kg體重的2 mg / mL的鹽酸阿霉素(上海生工)，共連續注射10 d，其余組別大鼠同時間周期內每日注射等量的生理鹽水作為對照。

1.3 運動方案

對于EX組、EX +DOX組、EX +GA組以及EX +DOX+GA組大鼠，在分組后的第二天開始進行為期8周的跑臺訓練，每周訓練6 d，每天訓練30 min，跑速為30 m/min。

1.4 取材

8周的運動和藥物干預后，于跑臺訓練組大鼠最后一次訓練結束后24 h，斷頸椎處死所有大鼠，在斷頸椎后迅速心臟取血[10]，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，分離血清，-20 ℃ 冰箱內保存待測血鈣(Ca2+)、血清堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)等血清骨代謝指標。分離大鼠左側股骨，用浸透生理鹽水的紗布包好，于-20 ℃ 冰箱內保存待測BMD。

1.5 測試方法

鄰甲酚酞絡合酮終點比色法(南京建成試劑盒)測定血鈣(Ca2+)，MODULAR 全自動生化分析儀(日本)(美國Roche公司試劑盒)測定血清堿性磷酸酶(ALP)；骨鈣素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)的測定采用酶免法(美國ADL 公司試劑盒，美國MUL2TISCAN MK3酶標儀)。

股骨骨密度的測定采用pDEXA 型雙能X 線骨密度儀(美國Norland 公司)測定，將股骨從-20 ℃冰箱取出，室溫自然解凍12 h，雙能X 線骨密度儀掃描整個股骨，測定其骨密度。

1.6 統計學處理

各檢測結果以平均數±標準差表示，用SPSS11.0軟件對組間差異進行方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義，以P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠股骨骨密度

由圖1可知，首先，DOX與GA的單獨或聯合給藥均顯著降低了各組大鼠的骨密度，即SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組大鼠股骨骨密度均顯著低于其對應的非藥物干預組SED組(P< 0. 01)；同樣，EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠股骨骨密度均顯著低于其對應的非藥物干預組EX組(P< 0. 01)。其次，DOX和GA聯合干預對于大鼠骨質疏松的影響顯著大于DOX或GA單獨給藥的影響，即SED+DOX+GA大鼠股骨骨密度顯著低于SED+DOX組和SED+GA組(P< 0. 01)；同樣，EX+DOX+GA組大鼠股骨骨密度顯著低于EX+DOX組和EX+GA組(P< 0. 01)。再次，跑臺運動顯著降低了DOX與GA的單獨或聯合給藥造成的骨質流失，即EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組股骨骨密度均顯著高于其對應的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P< 0. 05或P < 0. 01)。

圖1 各組大鼠股骨骨密度比較注：藥物干預組與其對應的非藥物干預對照組相比較，@@P<0. 01；藥物聯合干預組與其對應的藥物單獨干預組相比較，**P<0. 01；跑臺運動組與其對應的安靜組相比較，#P<0. 05或##P<0. 01Fig.1 Comparison of BMD of the femur between each group

2.2 各組大鼠骨代謝指標

由表1可知，首先，DOX與GA的單獨或聯合給藥均使大鼠的骨形成指標ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，即SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA大鼠的血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著低于其相對應的非藥物干預組SED組(P<0. 01)，而SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA大鼠的血清骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著高于其相對應的非藥物干預組SED組(P<0. 01)；同樣， EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著低于其相對應的非藥物干預組EX組(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著高于其相對應的非藥物干預組EX組(P<0. 01)。其次，DOX和GA聯合干預對于大鼠骨代謝指標的影響顯著大于DOX或GA單獨給藥的影響，即SED+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著低于SED+DOX組和SED+GA組(P<0. 01)，而SED+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著高于SED+DOX組和SED+GA組(P<0. 01)；同樣， EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著低于EX+DOX組和EX+GA組(P<0.01)，而EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著高于EX+DOX組和EX+GA組(P<0.01)。再次，跑臺運動顯著降低了DOX與GA單獨或聯合給藥對大鼠骨代謝造成的影響，即EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著高于其相對應的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著低于其相對應的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P<0. 05或P<0. 01)。

3 討論

3.1 阿霉素與醋酸戈舍瑞林聯合作用對大鼠骨密度和骨代謝的影響

DOX是臨床上廣泛應用的治療腫瘤的藥物之一，通過嵌入DNA，抑制拓撲異構酶II和解旋酶的作用，產生活性氧而有效抑制各種惡性細胞的生長和增殖[11]。但是，DOX也是已知的可使骨量減少的藥物之一，DOX給藥可以顯著降低骨礦含量和骨密度[12]。本研究的結果也進一步證實，與其相對應的非藥物干預組SED組和EX組相比，SED+DOX組和EX+DOX組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，這說明DOX可造成大鼠骨形成作用減弱而骨吸收作用增強，加速骨質的流失，并最終導致骨密度的下降。DOX毒性眾所周知的機制是其與線粒體相互作用導致的活性氧的增加，從而造成細胞的損傷，所以DOX與骨細胞線粒體相互作用產生的自由基對骨細胞造成傷害，這極有可能是DOX造成骨質疏松的重要原因之一。此外，DOX可通過對于卵巢的損傷，減少雌激素的分泌，并進而對骨代謝造成不良影響，這也是DOX造成骨代謝失平衡的原因之一[13]。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標的比較Table 1 Comparison of serum bone metabolic markers between each

注：藥物干預組與其對應的非藥物干預對照組相比較，@P<0.05或@@P<0.01)；藥物聯合干預組與其對應的藥物單獨干預組相比較，**P<0. 01；跑臺運動組與其對應的安靜組相比較，#P<0. 05或##P<0. 01

在應用DOX治療各種癌癥時，DOX對于患者卵巢的損傷也是目前臨床上所面臨的一個主要問題。研究顯示，在應用DOX治療各種癌癥時，DOX則會首先蓄積在位于卵巢中心的基質細胞，隨后逐漸向卵巢周邊區域積累，并最終導致卵巢細胞的凋亡[14]。在癌癥患者的臨床治療中，為了抑制卵巢的功能從而避免DOX對于卵巢的損害，在DOX給藥之前和給藥期間，經常采用聯合GA給藥的措施。

然而，GA在抑制卵巢功能的同時也大大降低了雌激素的分泌，鑒于雌激素對于骨代謝的重要作用，GA的給藥將有可能進一步加重DOX對骨代謝造成的不利影響。研究顯示，接受GA治療的患者雌激素水平則會下降到絕經后水平[15]，而雌激素水平的迅速下降對于骨代謝的負面影響已是眾所周知，絕經后婦女由于雌激素的迅速下降而易患骨質疏松癥已是不爭的事實[16]。Hydock等[17]的研究表明，8周的GA給藥可以顯著降低雌性大鼠脛骨近端松質骨的骨量。本研究的結果也顯示，與其相對應的非藥物干預組SED組合EX組相比，SED+GA組和EX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，進一步證實了GA通過破壞大鼠骨代謝的動態平衡，造成大鼠骨質的流失。

關于GA和DOX聯合用藥對骨代謝影響的研究目前在國內外尚未見報道，本研究顯示，聯合GA和DOX給藥比單獨的GA或DOX給藥可造成更嚴重的骨量丟失。與SED+DOX組和SED+GA組相比，SED+DOX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，同樣與EX+DOX組和EX+GA組相比，EX+DOX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著升高。這說明，臨床上在應用DOX治療各種癌癥時，經常采用聯合GA的給藥，雖然可以顯著降低DOX對于卵巢的損傷，但同時也加重了DOX對于骨組織的損傷。這兩種藥物對骨代謝的累加效應，可能是通過其對成骨細胞和破骨細胞的作用實現的。研究顯示，不僅雌激素能夠調節成骨細胞和破骨細胞的生成和細胞凋亡[18,19]，而且DOX也可以以劑量依賴性的降低成骨細胞活性[20]和增加破骨細胞的活性[21]。而GA對骨代謝造成影響的原因可能主要是由于其導致的雌激素分泌減少與DOX共同作用于成骨細胞和破骨細胞，干擾正常的骨轉換過程，從而導致骨質的加速流失，這將是臨床上接受GA聯合DOX治療方案的癌癥患者和醫學工作者們所面臨的一個重要的問題。

3.2 跑臺運動對阿霉素聯合醋酸戈舍瑞林誘導骨質疏松大鼠骨密度和骨代謝的影響

DOX和GA單獨或聯合用藥導致的骨質流失的問題已經成為困擾臨床上乳腺癌等癌癥患者接受治療的重要問題之一[22]，而減少這種骨質流失的干預方法也已經引起了科研人員的廣泛關注[23]。近年來，人們也一直在研究關于癌癥治療相關的骨量丟失的干預措施，包括使用雙膦酸鹽，維生素D和鈣補劑等[24]。此外，運動能夠對骨代謝產生積極的影響，運動時肌肉的收縮以及運動時來自地面的反作用力，都能夠對骨組織產生相應的力學刺激，從而有利于骨量的積累[25]。運動也是近年來已被提出的作為保護由癌癥治療引起的骨量丟失的干預措施之一[26]。

研究顯示，單純的使用運動干預并不足以抵消雌激素缺乏所造成的骨損傷[27]，因此，運動聯合應用其它的骨保護干預措施來減少GA誘導的骨量丟失應該是必要的，例如運動聯合雙膦酸鹽[28]和維生素D3[29]的補充等。有研究顯示，自愿轉輪運動對GA誘導的雌性大鼠脛骨松質骨骨質疏松幾乎沒有保護作用，并且作者推測自愿轉輪運動缺乏對骨組織的保護作用是因為其零星的運動時間以及這種運動方式對骨組織產生的機械應力較小[30]。此外，也有研究表明，自愿轉輪運動對DOX誘導的生長期大鼠的骨質流失也同樣沒有保護作用[31]。鑒于以上兩項研究結果，我們有必要研究其他能夠控制運動強度和時間，而且能夠對骨組織產生較強機械刺激的運動方式對于GA和DOX誘導的骨質疏松的保護效果。已經有研究提出具有較強力學刺激的運動方式可作為減少這種骨質流失的重要方法之一[32,33]。本研究結果顯示，跑臺運動可以顯著降低DOX與GA的單獨或聯合給藥對大鼠骨密度和骨代謝造成的負面影響，與其相對應的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組相比，EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠骨密度顯著升高、血清骨形成指標ALP和BGP水平顯著升高而骨吸收指標Ca2+和TRACP5b水平顯著降低，證明了跑臺運動對于DOX聯合GA誘導骨質疏松具有較好的防治效果。

在以往的臨床研究中，盡管運動已被證明是一種減少化療引起的骨量丟失的有效方法[34,35]，但以往的臨床研究中患者接受的抗癌藥物有些是含有DOX和GA的，有些則不含DOX和GA，雖然接受化療的癌癥患者仍然比健康對照組患骨質疏松癥的幾率顯著提高[34]，但也很難就此推測癌癥患者的骨量丟失是否是由于抗癌藥物DOX和GA引起的。此外，由于癌癥患者患病后體力較差，會出現患病后長期靜臥缺乏運動的生活方式，即其骨質疏松癥也有可能是由于患病后長期靜臥缺乏運動導致的，或者可能是抗癌藥物和缺乏運動共同作用的結果，故臨床的統計數據很難避開這些因素的干擾。在本研究中，選取健康大鼠作為研究對象，在其藥物干預期間，各組大鼠在飼養籠中的日?；顒恿繋缀鯖]有差別，這就避免了臨床上癌癥患者久臥少運動的生活狀態對于骨代謝的負面影響，DOX和GA藥物干預組與非藥物干預組大鼠骨密度及骨代謝的差異就可以認為是單純的藥物作用的效果。同樣，在本研究中，跑臺運動對于DOX和GA誘導骨質疏松的防治效果也避開了臨床上癌癥病人久臥少運動的生活狀態對于實驗數據的干擾。

4 結論

1．DOX和GA單獨或聯合作用均可造成大鼠骨代謝的失平衡和骨密度的下降，導致大鼠骨質疏松癥的發生。

2．DOX和GA聯合作用誘導大鼠骨質疏松的程度顯著大于DOX或GA單獨作用的結果。

3．跑臺運動可以有效降低DOX和GA單獨或聯合作用誘導的骨密度下降和骨代謝失平衡，降低大鼠骨質疏松的程度。