釩酸鹽對I型糖尿病大鼠骨礦鹽代謝及骨顯微結構的影響

裴祎 張曉晶 鄭珂 王巍 穆帥 薛峰 滕松齡 付勤

中國醫科大學腫瘤醫院/遼寧省腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科，遼寧 沈陽 110042

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足或機體對胰島素利用效率低而引發的慢性疾病。糖尿病性骨質疏松[1]是指糖尿病患者并發單位體積內骨量減少、骨組織微觀結構改變、骨強度降低、脆性增加等易發生骨折的一種全身性、代謝性骨病。因此對糖尿病性骨質疏松發病機制及其防治的研究，已成為骨質疏松癥基礎和臨床亟待解決的重大問題。目前普遍認為糖尿病性骨質疏松是一種多病因疾病[2]，糖尿病發生后會引起全身骨痛，易發骨折，致殘致死率高，已經證實長期高血糖狀態會影響三大物質代謝障礙；同時胰島素缺乏使成骨細胞的分化和增殖減弱，數目減少、活性降低，抑制骨膠原合成[3]；同時還可抑制成骨細胞合成骨鈣素，從而導致骨吸收增多，骨量丟失增大[4]，降低骨轉化率等。因此，無論是探討發病機制還是解決臨床防治問題，有效控制血糖、避免胰島素缺乏是提高骨骼質量和預防糖尿病性骨質疏松發生的關鍵。

釩是人體必需的微量元素之一，具有降血糖、抗炎、抗癌、等多種生理功[5]。在體內，釩有四價、五價等多種化合態，1980年Schecher等首先發現釩具有很好的體外胰島素樣活性。近年來許多學者亦通過大量實驗研究發現，口服釩酸鹽無論對Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病動物模型的血糖都能降至或接近正常的水平，這充分顯示了釩酸鹽的降糖作用[6]。從以往的研究中發現，釩酸鹽可以通過其類胰島素作用改善大鼠因缺乏胰島素而導致全身高血糖狀態，而這種類胰島素的降糖作用能否進一步延緩、甚至阻止糖尿病性骨質疏松的發生、發展？本研究的目的是通過檢測金屬釩治療前后糖尿病大鼠骨代謝指標的動態變化，探明金屬釩對糖尿病性骨質疏松骨代謝及骨顯微結構的作用。旨在為開發和研制有效改善和治療糖尿病性骨質疏松的藥物提供理論支持和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：45只2月齡雄性Wistar大鼠，體重(225±25) g，由中國醫科大學動物實驗中心提供。

1.1.2飼養環境：動物飼養場地在中國醫科大學動物實驗中心，其環境符合衛生檢疫標準。室溫(20±1)℃、濕度為20%，照明晝夜明暗交替時間為1212，大鼠自由飲水、進食。適應性喂養7 d后，進入實驗狀態。

1.1.3藥物：佐鏈尿菌素，釩酸鹽(Betapharma有限公司。上海，中國)。

1.1.4主要儀器：Micro-CT(SCANCO Medical AG, Switzerland )；高精度數顯光柵位移傳感器(Instron Corporation，AM)；阿波特300i化學分析儀(Abbott Diagnostics，Abbott Park， IL，USA)；Microscope(Olympus)；Zwick-Z010 生物力學檢測儀(Z010，Zwick GmbH， Ulm)。

1.2 實驗方法

45只雄性Wistar大鼠被隨機分為3組：對照組(n=15)、高血糖組(n=15)、高血糖+釩治療組(n=15)。首先對高血糖組、高血糖+釩治療組大鼠進行I型糖尿病造模，對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水作為對照組。以8 w齡Wistar雄性大鼠按45 mg/kg體重注射佐鏈尿菌素，制作糖尿病大鼠模型。造模后第3天、5天、7天尾靜脈采血測血糖，以3次血糖均值大于13 mmol/L為糖尿病造模成功鼠。對照組僅注射生理鹽水，不影響胰島細胞功能。若3次血糖值<13mmol/L，則認定造模失敗。造模成功后，給予高血糖+釩治療組糖尿病大鼠應用釩治療，每只大鼠按0.18 mg/(kg·d)釩計量喂養，每只大鼠通過灌胃治療，治療共持續12 w。對照組、高血糖組則以生理鹽水灌胃進行對照。連續喂養12 w，每周分別對3組大鼠進行體重、血糖監測。喂養第12周結束以后，分別取3組大鼠脛骨、股骨進行micro-CT檢測、組織形態學檢測、生物力學檢測、骨礦含量檢測、評價鈣鹽含量等相關指標。

1.3 檢測項目

1.3.1Micro-CT：利用臺式micro-CT對所有實驗動物的脛骨進行檢測分析(SCANCO Medical AG，Switzerland )。沿著整個脛骨的長軸，掃描600層，層厚40 μm，已通過脛骨近端部分的區域作為選定區域[7-8]，包括在內的上下各100層進行數據統計。三維骨小梁結構參數可以直接測量出來：骨小梁體積(bone volume，BV)、被測樣品總體積(tissue volume，TV)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)。

1.3.2骨組織形態計量學觀察參數：利用10%乙二胺四乙酸(EDTA)將股骨脫鈣，石蠟包埋后，縱切。利用顯微鏡上的投影描繪器和分析軟件(Image-Pro 4.0 analysis software)對組織形態測定結果進行分析。每個切片厚度為5 μm，均選擇10個松質骨區域，放大200倍進行檢測。每個區域中選擇組織3～5處切片位置，使實驗更具有一致性，并減少誤差。

1.3.3大鼠離體股骨生物力學測試：應用三點應力載荷測量股骨機械強度。Zwick-Z010 testing systems(Z010，Zwick GmbH，Ulm)室溫條件下，股骨緩慢融化后，除去附著在骨上的軟組織，并將股骨遠端浸潤水泥，以防止發生旋轉，產生旋轉方向應力，影響測量結果。將樣本放置在三點應力測試器上，跨距為40 mm，2 mm/min 的速度勻速運動，直至樣本發生骨折。記錄骨折時，骨折載荷的最高值(牛頓，N)。

1.3.4骨礦物質含量測定：為了測定骨礦含量，將股骨620°C，48 h條件下礦化并測重。礦化骨溶解于6 M鹽酸溶液中，比色法測定骨礦含量中鈣的含量(Pointe Scientific 標準試劑盒)。

1.4 數據分析

數據收集在 Excel (Microsoft)文件里。Micro-CT 檢測所得骨小梁結構數據，組織形態測定所得數據，骨機械性能檢測所得數據以及骨礦物質含量均進行均數和標準差統計。組間差異統計利用ANOVA和 Post hoc Tukey’s test 檢驗用于組間差異統計。利用統計軟件SPSS 17.0進行統計分析，P<0.05 認為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠體重變化

喂養12 w期間，每周末對3組大鼠體重的測量值，見圖1。與對照組相比，高血糖組和高血糖+釩治療組的大鼠體重明顯下降。前4 w，高血糖組、高血糖+釩治療組的體重差異沒有統計學意義(P<0.05)，然而在第4周時，高血糖+釩治療組大鼠的體重開始明顯增加，但與對照組比較，體重增加并沒有達到標準值，這些結果說明，釩酸鹽能夠改善高血糖大鼠的體重指標，但不足以使之達到正常喂養值。

圖1 大鼠12 w內體重變化(a：與高血糖組比較，P<0.05)Fig.1 Body weight changes of rats in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.2 大鼠血糖變化

喂養12 w期間，每周末對3組大鼠血糖值進行分析，見圖2。在治療1 w后，高血糖+釩治療組血糖值與高血糖組比較明顯降低(P<0.05)，但是血糖值并未達到正常值。實驗結果說明釩酸鹽能夠顯著降低糖尿病大鼠的血糖值(圖2)。

圖2 大鼠12 w內血糖值變化(a：與高血糖組比較，P<0.05)Fig.2 Blood glucose changes in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.3 Micro-CT檢測

釩酸鹽對大鼠脛骨顯微結構的影響見圖3。高血糖組大鼠骨的骨小梁總量明顯降低，而高血糖+釩治療組明顯增加了小梁骨的比率。同時，高血糖+釩治療組對骨小梁顯微結構也具有一定的改善作用，其骨小梁寬度與糖尿病組相比明顯增加(P<0.05)。然而，在骨小梁數量和骨小梁間隙方面，高血糖+釩治療組與高血糖組相比并未有明顯的改善(P>0.05)。

圖3 釩酸鹽對高血糖大鼠脛骨顯微結構的影響。A：骨體積分數(BV/TV)；B：平均骨小梁寬度(Tb.Th)；C：平均骨小梁數量(Tb.N)；D：平均骨小梁間隙(Tb.Sp)。1：對照組，2：高血糖組，3：高血糖+釩治療組。與高血糖組比較，*P<0.05Fig.3 Effect of vanadium treatment on trabecular microarchitectural parameters. A: Percentage of total bone volume occupied by trabecular bone (BV/TV); B: Mean trabecular thickness (Tb.Th); C: Mean trabecular number (Tb.N); D: Mean trabecular separation (Tb.Sp). Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.4 骨組織形態計量學觀察參數

釩酸鹽治療組骨組織的組織形態學檢測結果見圖4。圖4A實驗結果說明高血糖組大鼠的破骨細胞數量明顯減少，說明高血糖狀態能夠抑制骨吸收，圖4B顯示，高血糖組成骨細胞表面與對照組相比明顯減少，這說明高血糖在抑制骨吸收的同時，也抑制了骨形成。通過釩酸鹽治療，破骨細胞數量并沒有提高，但成骨細胞表面明顯提高，結果說明，釩酸鹽治療不能改善骨吸收，但能夠促進骨形成。

圖4 釩酸鹽對高血糖大鼠組織形態學的影響。A：破骨細胞數量；B：成骨細胞表面。1：對照組，2：高血糖組，3：高血糖+釩治療組。與高血糖組比較，*P<0.05Fig.4 Effect of vanadium treatment on bone histomorphometry. A: Mean number of osteoclasts per square millimeter section; B: Percentage of trabecular bone perimeter occupied by osteoblasts. Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.5 大鼠離體股骨生物力學測試

12 w后對3組大鼠股骨進行生物力學測試見表1。結果發現，糖尿病鼠的骨骼質量比較差，抗壓力、結構強度、質量強度都明顯下降，而釩酸鹽治療組最大負荷載力明顯比高血糖組提高。然而，結構強度、質量強度與高血糖組相比，差異并無統計學意義(P>0.05)。

2.6 骨礦物質含量測定

與高血糖組相比，釩治療組顯著提高骨組織的骨礦含量。糖尿病平均骨鈣、磷含量分別為(94.53±6.18) mg/g和(44.37±3.16) mg/g，然而釩治療組鈣磷含量為(91.56±8.94) mg/g和(55.65±4.35) mg/g。結果說明，釩主要增加骨骼中磷的含量，然而對鈣含量的增加無顯著作用。

表1 各組生物力學檢測Table 1 Biomechanical properties in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，與高血糖組比較，#P<0.05。

表2 各組骨礦含量檢測Table 2 Bone mineral content in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，與高血糖組比較，#P<0.05。

3 討論

通過實驗發現，釩酸鹽確實能夠降低I型糖尿病大鼠的高血糖狀態，并且隨著大鼠的血糖下降，體重逐漸升高。進一步觀察發現，體重的增加滯后于血糖的下降，滯后時間約2 w，而且隨著血糖值的穩定，體重值穩步上升，這些結果說明，降低大鼠血糖值對于改善體重有重要意義。

評價骨骼強度的高低，最直接的方法就是測量骨的生物力學強度。之前的研究已經證明，無論體內、體外實驗，釩的許多復合物都有類胰島素作用[9-11]，而且隨著血糖值的升高，影響骨骼強度的相關指標會明顯降低[12-13]。從實驗中發現，高血糖組大鼠的最大負荷載力、結構強度、能量吸收值均明顯降低。通過釩酸鹽12 w的喂養，最大負荷載力明顯提高，但是結構強度、能量吸收值的變化并沒有統計學意義。這說明釩酸鹽治療可使受損的最大負荷載力得到改善。

另一項評價骨骼強度指標是對骨顯微結構的評價。Bauer等[14]發現了骨的顯微參數能夠用來評價骨的生物力學強度。Link等[15]發現了骨的顯微結構與骨的生物力學有關。進一步的示例中證明，骨的顯微結構能夠揭示骨的強度，以及骨折的危險度[16-18]。從骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)的結果來看，高血糖組和高血糖+釩治療組骨小梁數量明顯減少，骨小梁間隙明顯增大，骨質疏松程度更加嚴重。骨小梁主要由細胞外基質(礦物和膠原)組成，糖尿病會影響膠原合成及礦化。長期高葡萄糖濃度會增加糖基化終末產物的量，大量的終末產物在骨膠原蛋白上堆積，影響了膠原上鈣鹽的沉積及礦化。因此，骨小梁數量減少和缺乏更緊湊的骨小梁間隙的原因可能是沒有足夠的膠原蛋白補充。然而，在釩酸鹽治療組中，骨小梁厚度明顯增加(P<0.05)。這說明釩酸鹽主要是通過增加骨小梁厚度，改善骨骼強度。釩酸鹽通過降低高血糖狀態，減少糖基化終末產物在膠原蛋白上堆積，進一步增加了成骨細胞在膠原蛋白上的黏附作用，因而改變了成骨細胞的功能及其分化和增殖作用，促進骨形成并進一步提高骨礦鹽含量。實驗研究表明，釩酸鹽治療組的骨礦含量和磷含量的增加，但是組織的礦物質鈣含量的差異無統計學意義(P<0.05)。

shyng等[19]研究者發現，在I型糖尿病模型中，成骨細胞的數量和骨形成大大降低了，糖尿病大鼠破骨細胞的數量也在減少[20]。在糖尿病骨質疏松的發病機制中，已經被證實的是骨轉換的降低，而不是過度的骨吸收[21]。在本研究中，釩酸鹽對糖尿病大鼠股骨組織中的成骨細胞數量增加，而破骨細胞數量值沒有明顯改變。體外研究已經發現，金屬元素釩可以增加成骨細胞數量[22-23]。釩可以提高成骨細胞對胰島素的反應，以增加其活性，并可以促進骨形成增加[24-25]。破骨細胞已證實有胰島素受體，但不受胰島素響應，所以破骨細胞對釩的類胰島素作用無反應。因此，釩酸鹽治療可以改善糖尿病大鼠的促成骨細胞骨形成作用。然而，僅僅對觀察性研究和動物模型得出的結論仍然是不夠充分的。Facchini等[26]研究證實，釩化合物可能會增加破骨細胞的活性。因此，不能排除釩對破骨細胞作用的可能性、釩還可能直接作用于破骨細胞并促進破骨細胞的活性、加快糖尿病大鼠骨的快速重構。

總之，本實驗證實高血糖狀態對骨的生物力學、骨形成、骨顯微結構都產生消極的影響，給予釩酸鹽治療后，可以糾正糖尿病骨代謝狀態，可促進骨形成，進一步提高骨代謝率，并能改善骨顯微結構。糖尿病性骨質疏松是一個復雜的骨代謝疾病，在疾病發生、發展過程中有多種因素參與，各個因素之間的相互關系以及它們在代謝過程中所起的作用還沒完全了解，因此還需要在以后的工作中更加系統、深入的研究。