應用原子力顯微鏡觀察脈沖電磁場對大鼠骨質疏松的治療后骨組織表面超微結構的變化

鄧紫婷 何紅晨 肖登

重慶醫科大學附屬康復醫院，重慶 400050

骨質疏松癥在世界多發病中列第6位，是發達國家最重要的健康問題之一，也是發展中國家一個日益突出的問題。2001年發表的美國國立衛生研究院關于骨質疏松的預防、診斷和治療共識[1]，認為本病的特征是骨強度損害，骨折的危險增加。骨強度主要反映骨密度(BMD)和骨質量的完整性[2]，骨質量包括骨結構、骨轉換、骨損傷的積累(比如微骨折)、骨礦化和骨材料的特性。目前治療骨質疏松的藥物繁多，但是因為治療周期長且副作用多，患者多難以堅持，由此脈沖電磁場物理治療骨質疏松，因其效果明顯，無明顯副作用從而得到患者認可。但是臨床雖然觀察到脈沖電磁場治療骨質疏松有效，卻并無明確治療骨質疏松的治療機制，為此進行了其治療機制的研究。

而原子顯微鏡由于探針的針尖尺寸只有原子大小, 因而其分辨率可以達到納米級[3]，能對從原子到分子尺寸的結構進行三維成像和測量,這是掃描電子顯微鏡很難達到的[4]。因此我們利用原子力顯微鏡對骨組織進行觀察，研究其生物力學性能[5]，闡明脈沖電磁場治療骨質疏松時骨組織的表面超微結構變化。

1 材料和方法

1.1 動物和藥品

清潔級SD大鼠60只(由重慶醫科大學實驗動物中心提供)，雌性,體重(200±20)g，鼠齡3個月。飼養環境室溫(20～25)℃，相對濕度50%左右，日照12 h，室內通風良好，飼料和飲水均由動物中心提供，大鼠飲食及飲水自由。所有實驗大鼠均采用籠養管理。

1.2 試劑和儀器

阿倫膦酸鈉：石藥集團歐意藥業有限公司，70 mg/盒，批號：H20061303；脈沖電磁場治療儀：蘇州好博公司，型號：HB 320；原子力顯微鏡: 由中科院智能研究中心提供，型號：Bruker/Dimension edge。

1.3 分組和造模

按SPSS軟件產生的隨機數字表將其分成對照組(Sham組)、去卵巢組(OVX組)、阿倫膦酸鈉治療組(ALN組)、PEMFs治療組(PEMFs組)，每組大鼠15只。骨質疏松模型的建立采用去雙側卵巢法。除Sham組外對其他各組行雙側卵巢切除術，手術方法如下[6]：5%水合氯醛按 0.6mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉完畢后，將SD大鼠 俯臥位固定于手術臺上，背部常規備皮，常規消毒、鋪巾，經腰背部切口進入腹腔，切除兩側卵巢，仔細止血，沖洗后逐層縫合肌肉、皮下組織、皮膚，對合皮膚，用75%酒精、碘酒消毒皮膚。術后每天青霉素4萬U肌注，共5天。Sham組僅切除卵巢部分周圍脂肪。

1.4 給藥方法

造模結束后第30天開始分組干預，依據Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量，用電子稱稱取所需量的阿倫膦酸鈉，用生理鹽水配置成相應濃度，置于酒精燈上加熱溶解后，冷卻備用。ALN組給予阿倫膦酸鈉灌胃，劑量2 mg/(kg·d)，1次/d，治療30 d。PEMFs組的脈沖電磁場治療儀治療，治療參數為：3.8 mT，8 Hz，每天治療2次，每次40 min，治療30 d。Sham組和OVX組手術后正常喂養，不予任何處理。

1.5 觀察指標

每周各取大鼠股骨頭部分進行石蠟包埋后均勻切成厚約5 mm左右切片，將脫鈣脫蠟切片保存于60%～70%酒精玻璃缸，用AFM分別觀察各組骨組織的骨陷窩、骨小管及鈣磷晶體，并計算其表面粗糙度，進行統計分析。

1.6 AFM掃描方式

采用AFM觀察, 掃描速率512 Hz。采用8 nm長、彈性系數k為40 N/m的Si3N4微懸臂, 掃描范圍5 μm×5 μm至1 μm×1 μm, 以輕敲模式(tapping mode)在大氣和室溫下直接觀察標本。用倒置相差顯微鏡觀察股骨頸情況并選擇合適的掃描區域，每組隨機選擇3個標本進行掃描，每個標本分別隨機選擇3 個不同的部位進行5 μm×5 μm范圍的掃描；每個部位選擇1個區域進行1 μm×1 μm掃描。當掃描范圍為5 μm×5 μm時, 圖像采集為恒力模式(height mode)；掃描范圍為1 μm×1 μm時, 圖像采集為相位模式(phase mode)及恒力模式(height mode)。

骨組織表面粗糙度分析方法是隨機選擇每組的圖像(1 μm)各9 張, 且每張圖像隨機選取3 個不同部位, 應用分析軟件(Version5.12R2;Digital Instrμments)進行分析。并應用系統軟件對1μm的圖像進行三維結構的立體重建。所有采集圖像均通過自動平滑(flatten auto)處理以消除慢掃描方向的低頻噪音。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 骨組織的AFM超微結構像

圖1 骨組織的AFM超微結構Fig.1 Ultrastructure of bone tissue by using atomic force microscopy

當掃描范圍為5 μm ×5 μm時, AFM可以顯示, 對照組(Sham組)組織表面形態和超微結構示：鈣磷晶體呈小柱狀排列，骨小管溝通骨陷窩，骨陷窩為不規則橢圓形結構，長軸直徑為0.3～1.2 μm，每個骨陷窩有10～60條骨小管與其交通，相鄰之間的骨陷窩間隔為0.2～0.5 μm，鈣磷晶體排列呈小柱狀，環繞著哈佛系統排列，單個晶體大小為0.06～0.2 μm,但仍有少數晶體大小為0.04 μm(圖1)。當掃描范圍縮小至1 μm ×1 μm時, 組織表面變得凹凸不平, 其中可見許多顆粒狀物質, 呈柱狀排列, 部分融合呈片狀，可見大小不等的凹陷結構域(圖1)。

去卵巢組(OVX組)可見骨小管直徑大小不一，骨陷窩數量明顯增加，成不規則橢圓形結構，大部分融合為一體。鈣磷晶體大小不等，排列紊亂，部分呈團狀排列，單個晶體大小為0.03～0.15 μm(圖1)。

阿倫磷酸鈉藥物治療組(ALN組)可見鈣磷晶體環繞著哈佛系統較為規律的排列，骨陷窩數量有所增多，成不規則橢圓形結構，少部分有融合現象，每個骨陷窩有骨小管與其交通，排列不規則(圖1)。

PEMFs治療組(PEMFs組)鈣磷晶體部分呈小柱狀排列，有部分呈團狀分布，大小不等；部分骨小管溝通骨陷窩，骨陷窩為不規則橢圓形結構，數量增多，長軸直徑為0.5～2.2 μm，骨陷窩排列紊亂，部分融合成片(圖1)。

2.2 骨組織表面粗造度

模型組骨組織表面粗糙度明顯高于對照組(P<0.01), 提示造模成功，ALN組表面粗糙度明顯低于OVX組(P<0.05)，PEMFs組的表面粗糙度與OVX組相比，有明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，而PEMFs組與 ALN組比較，其表面粗糙度無明顯差異(P>0.05)(表1、圖2)。

表1 各組大鼠骨組織表面粗糙度(Rq)分析(μm，±s)Table 1 Analysis of bone surface roughness (Rq) of rats in each group(μm，±s)

注：Sham組與OVX組比較，aP<0.01； Sham組與ALN組比較，bP>0.05；Sham組與PEMFs比較，cP>0.05；ALN與OVX組比較，dP<0.01；PEMFs與OVX組比較，eP<0.05；PEMFs與ALN組比較，fP>0.05

圖2 各組大鼠骨組織表面粗糙度Fig.2 Bone surface roughness of rats in each groupSham組與OVX組比較，aP<0.01； Sham組與ALN組比較，bP>0.05；Sham組與PEMFs比較，cP>0.05；ALN與OVX組比較，dP<0.01；PEMFs與OVX組比較，eP<0.05；PEMFs與ALN組比較，fP>0.05

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種以骨量減少，骨微結構破壞，導致骨骼脆性增加，容易發生骨折為特征的全身性骨病。目前我國60歲以上老齡人口估計有1.73 億，是世界上老年人口絕對數量最多的國家。據我國大規模流行病學調查顯示: 50 歲以上人群以椎體和股骨頸骨密度值為基礎的骨質疏松癥總患病率女性為20.7%，男性為14.4%， 60歲以上人群中骨質疏松癥的患病率明顯增高，女性尤為突出[7]。骨質疏松的發病率逐漸上升，使骨質疏松成為了我國的公共健康問題。

目前治療骨質疏松的藥物頗多，但其副作用及治療費用使許多患者無法長期堅持治療，而脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields, PEMFs)是由電流通過赫爾姆茲線圈所產生的具有脈沖間歇的磁場效應，最早用來治療骨折延遲愈合及骨不連等，用于骨質疏松的治療起源于 Bassett，他總結了 20 多年 PEMFs 治療的實驗研究，并用 Wolff 定律歸納其機理，認為生物電在骨的代謝和重建中具有十分重要的意義，預言 PEMFs治療骨質疏松具有良好的應用前景[8]。其具有安全無創傷、副作用少、治療便捷、依從性好等多個優點。經過大量的動物實驗研究及臨床應用，人們對脈沖電磁場的作用有了更加深入的認識。

在臨床研究中，劉穎等[9]通過40例患者觀察低頻脈沖電磁場與阿侖膦酸鈉治療絕經后骨質疏松癥的療效比較發現，與阿侖膦酸鈉治療比較，短期內脈沖治療在緩解疼痛，提高骨質量和增加肌力方面具有與阿侖膦酸鈉相同的效應，尤其是提高腰背肌肌力優于阿侖膦酸鈉。劉勇華等[10]通過對120例患者進行脈沖電磁場治療骨質疏松，發現脈沖電磁場可緩解原發性骨質疏松癥的骨痛，效果較為顯著，能夠明顯改善患者的日常生活活動能力，可提高骨密度。

而基礎研究中人們發現低頻脈沖電磁場對于細胞的分化增殖具有促進作用。Chen等[11]研究發現 PEMFs 通過促進成骨細胞的增殖，而非增強成骨細胞分化來促進骨形成。周君等[12]通過脈沖電磁場聯合電針療法對去卵巢大鼠骨質疏松實驗研究發現，脈沖電磁場在增加腰椎椎體骨密度，改善腰椎椎體骨生物力學性能方面優于脈沖電磁場或電針療法單獨使用。謝肇等[13]發現脈沖電磁場對去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞活性增強，沒有出現明顯的凋亡情況，但是使破骨細胞的活性減弱，而且可以見到明顯凋亡現象。并探討了治療骨質疏松癥的機制。宋昆等[14]發現脈沖電磁場可促進成骨細胞的增殖、分化和鈣鹽分泌，從而加速傷骨愈合、加快骨組織代謝，同時應用表面增強拉曼光譜技術探索了電磁場對成骨細胞的作用機制。Querido等[15]的研究結果發現經過脈沖電磁場刺激后，聚集在成骨細胞的礦化增加，再通過利用掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡以及透射電子顯微鏡的觀察發現成骨細胞礦化結節的特點為低結晶羥基磷灰石。

目前已經對脈沖電磁場治療骨質疏松的機制進行了多方面探討，已經取得進展，其中包括對其進行宏觀生物力學的研究，證明脈沖電磁場對于骨質疏松大鼠的生物力學性能有明顯療效。據研究發現，通過觀察骨組織中超微結構可以獲得其對骨的力學和生理性能的影響，從而提高對骨質疏松及骨折風險預測的準確性[16]。研究表明，微計算機斷層掃描技術(micro-computed tomography，micro-CT)已能準確獲得骨細觀結構參數，但無法完全獲得骨表面的微觀結構形態[17]。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)則被證實能有效地觀察到骨表面的活性狀態，并確定骨結構的完整性[18]。而為了獲得骨結構的微觀表征，研究者又將原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)應用于骨的各種研究中[19-22]。Milovanovic等[21]使用AFM觀測到老齡女性股骨頸松質骨的礦物顆粒尺寸要大于年輕女性，從而導致老齡女性松質骨的彈性降低，骨折發生率增加。Zhang等[24]通過間歇性高頻率低載荷的全身振動對大鼠后肢廢用導致的骨質疏松進行試驗，試驗發現骨宏觀力學性能的差異主要是由其微觀結構的變化而引起，并非是因為骨材料本身發生了變化。而間歇7 天的高頻率低載荷全身振動能有效地改善了骨的宏觀生物力學特性和微觀結構。Lin等[25]通過AFM可清晰觀察到牛的密質骨的微觀結構，清晰顯示了骨陷窩-骨小管網絡結構在縱向、橫向的大小尺寸。而陳斌等通過AFM對新鮮人尸體肱骨的觀察發現，在AFM下，骨組織中鈣磷晶體呈柱狀排列，骨小管溝通骨陷窩，骨小管直徑100～300 nm，骨陷窩為橢圓形結構，長軸直徑4.1～10.5 μm,在礦化區膠原蛋白纖維增厚，呈小盤疊加形態。

本實驗通過原子力顯微鏡觀察大鼠骨組織，根據三維高度圖及相位圖顯示，Sham組可見骨小梁中骨陷窩規律排列，骨小管與之相溝通，形成穩定的網絡結構，在骨陷窩及骨小管周圍有大量鈣磷晶體呈柱狀排列，骨陷窩及骨小管圍繞哈弗管呈同心圓排列，起穩定骨細胞及營養支持作用，這與Lin、Zhang等觀察到的相一致。而在OVX組可明顯觀察到骨陷窩形態大小變化，而其表面粗糙度與Sham組比較具有顯著差異(P<0.01)，即造模成功，表明經去卵巢手術后，由于雌激素水平低下，改變了大鼠的股骨頸骨組織表面超微結構，從而改變了骨組織的力學性能，為骨質疏松的形成奠定了一定理論基礎。PEMFs組與OVX組比較，PEMFs組可見骨陷窩呈不規則橢圓形，分布不規則，且鈣磷晶體排列較為紊亂，兩組之間的表面粗糙度差異具有統計學意義(P<0.05)，從力學特性角度反應脈沖電磁場治療組大鼠相對于骨質疏松組大鼠的骨重建速度較快[26]，即脈沖電磁場對于骨質疏松的治療是有效的。而ALN組與PEMFs組的骨組織在三維高度圖及相位圖下均可見不同程度骨陷窩形態大小變化，兩組表面粗糙度對比差異無統計學意義 (P>0.05)，即脈沖電磁場相對于阿侖膦酸鈉治療骨質疏松的療效沒有確切差異性。

總之本實驗利用AFM顯示, 脈沖電磁場治療大鼠骨質疏松癥與阿侖膦酸鈉治療骨質疏松癥的療效相當，而AFM作為一種簡單方便的研究方案可以為脈沖電磁場的治療骨質疏松時骨組織的超微形態學變化提供可靠的依據。