針刺對實驗性骨質疏松大鼠股骨骨折的預防作用

羅成斌 蔣春彥 朱珠 嚴晶 沈黎 李金艷 陳穎 趙榮*

1. 大理州中醫醫院，云南 大理 671000 2. 云南中醫學院，云南 昆明 650000 3. 昆明理工大學，云南 昆明 650000

絕經后骨質疏松癥是危害婦女身心健康的常見病，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種由內分泌、營養、免疫、遺傳等多種復合因素引起的代謝性疾病，是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加、易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。其所導致的骨折為脆性骨折，多發于脊柱、髖部和腕部，其中髖部骨折具有很高的致死率和致殘率。目前用于防治OP的藥物均存在一定的副作用[2]。越來越多的證據[3]顯示，生物物理干預可能提供一種安全、有效抑制并逆轉OP的方法，使骨量增加而不破壞骨重建過程。研究[4]表明針刺能夠防治骨質疏松癥，但對于針刺防治骨質疏松性骨折仍缺乏針對性強、證據確鑿的研究。我們前期的研究通過試驗證實了以足三里、腎俞、大杼為主穴的針刺方法能夠通過影響雌激素、骨鈣素、降鈣素等骨代謝指標來改善骨質疏松大鼠的骨顯微結構[5,6]；通過臨床證實以足三里、腎俞、大杼為主穴的針刺方法能夠明顯改善骨質疏松患者的生存質量，而且在研究當中通過實驗記錄和隨訪記錄，我們發現針刺能夠明顯地干預骨質疏松性骨折的發生[7]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組與模型制備

200只220～280 g 6月齡雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠(購自昆明醫科大學醫學實驗動物中心)。大鼠自由攝食和飲水，控制溫度在22±1℃和光照為12/12(光/暗)。所有大鼠在麻醉下進行卵巢切除術(腹腔注射200 g/L的烏拉坦胺1.0 mL/100 g，中國醫療化學有限公司提供)。在相同條件下飼養3個月，檢測絕經后骨質疏松癥動物模型成功后，將大鼠隨機分為3組:對照組(C，n=35)，阿侖膦酸鈉組(AS，n=35)和針刺組(A，n=35)。實驗程序均嚴格按照昆明醫科大學動物實驗操作指南(所有試驗均征得相關動物保護機構和使用協會同意)。

1.2 阿侖膦酸鈉和針刺治療方法

上午8:00-12:00，阿侖膦酸鈉組大鼠皮下注射阿侖膦酸鈉。阿侖膦酸鈉(10 mg/片，默克公司，進口藥品注冊證號：H20130557)，在PBS溶液中分解。按照200 μg/kg劑量換算的原則，阿侖膦酸鈉10 mg/片溶于5mLPBS溶液中，0.1 mL/kg皮下注射，每日1次，持續6個月。

上午8:00-12:00點，針刺組大鼠針刺雙側“足三里”、“大杼”、“腎俞”，留針3 min。每日1次，連續6個月。針具采用特制針(中國醫療設備有限公司提供)，直徑0.22 mm，長為10 mm，刺入時使用標準的壓力。腧穴定位根據Experiment Hcupunctwrology標準(林和王，1999)。足三里位于下肢的外側，外踝上大約1 mm；腎俞位于第二腰椎旁2 mm；大杼位于第一胸椎旁2 mm。所有大鼠均在自然狀態下，操作時研究人員以手輕輕固定，治療過程中大鼠無明顯疼痛或不適，可以自由活動。

1.3 指標檢測方法

1.3.1 在體股骨骨折最小外力檢測：治療6個月后，各組隨機選取6只大鼠進行在體股骨骨折最小外力檢測實驗。大鼠麻醉(腹腔注射麻醉)后，將右側下肢股骨上下兩端固定，應用在體股骨骨折最小外力檢測裝置(昆明醫科大學動物實驗室，自制設備)，依次通過遞增鐵片高度，鐵片(長70 cm，寬1 cm，重3.95 kg)自由墜落，從距離大鼠下肢1 cm高度開始自由落體向下落在大鼠股骨上段處(鐵片下端邊緣落在股骨中點處)。高度每次增加1 cm，直到大鼠股骨出現骨折為止。用小型X光機(云南省中醫學院提供)攝片觀察骨折的情況，并記錄發生骨折的情況和大鼠股骨出現骨折時鐵片墜落的高度。計算重力勢能(J=9.8×鐵片重量×高度)。

1.3.2 骨密度(BND)檢測：麻醉后，用DFDE-X骨密度儀 (昆明醫科大學第二附屬醫院提供) 掃描大鼠的右側股骨。掃描參數是1.0 mm×1.0 mm，60 mm/s，12.00 cm，REV.3.9.3/2.1.0。對所有標本均進行分析并計算出平均水平。

1.3.3 新鮮股骨形態學檢測：治療6個月，完成在體股骨骨折最小外力檢測和骨密度檢測后，安樂死處死所有動物，立即剝取完整右側股骨全長，剔除皮膚、肌肉，取股骨，除凈附著骨上的肌肉和軟組織，快速稱重后，用生理鹽水紗布包裹，置于-20℃保存。用感量為0.1 g的電子天平秤(云南省計量測試技術研究院提供)稱量股骨的重量。用精確度為0.02 mm游標卡尺(云南省計量測試技術研究院提供)測定其長度及近、中、遠三點的橫徑。三點橫徑測量點：股骨遠端(遠端股骨髁上至股骨髁)、中端(股骨干中點內外側)、近端(股骨頭至股骨轉子下)。

1.3.4 力學性能檢測：實驗電子機械測試機(昆明理工大學實驗材料中心提供)從日本島津公司購進，機械性能測定標準選用中國標準，取大鼠股骨做壓縮、拉伸中的最大值載荷、最大值應力、斷裂點載荷、斷裂點應力等系數測定。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結果

各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結果見表1。

表1 各組大鼠在體股骨骨折最小外力的測量結果±s，n=5)Table 1 The measurement results of the minimal external force in rats of each group(±s，n=5)

注：與對照組比較，*P<0.05

針刺組和阿侖膦酸鈉組在體股骨骨折最小外力均高于對照組(P<0.05)；針刺組和和阿侖膦酸鈉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠股骨BMD檢測結果

各組大鼠股骨BMD檢測結果見表2。

表2 各組大鼠股骨BMD檢測結果±s)Table 2 Detection results of BMD in the femur of ±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

針刺組和阿侖膦酸鈉組股骨骨密度均高于對照組(P<0.05)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠新鮮股骨骨形態學測試結果

各組大鼠新鮮股骨骨形態學測試結果見表3。

表3 各組大鼠新鮮股骨骨形態學測試結果±s)Table 3 Morphological test results of fresh femoral bone in rats of each group(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與阿侖膦酸鈉組比較，#P<0.01

針刺組股骨近端橫徑明顯變短與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；與阿侖膦酸鈉組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 各組大鼠股骨生物力學指標檢測結果

2.4.1 壓縮

各組大鼠股骨壓縮生物力學指標檢測見表4。

表4 股骨壓縮生物力學指標±s)Table 4 ±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與針刺組比較，#P<0.05

阿侖膦酸鈉組最大值載荷、最大值應力、斷裂點載荷、斷裂點應力均高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)；針刺組最大值應力、斷裂點載荷、斷裂點應力均高于對照組，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)；阿侖膦酸鈉組最大值應力、斷裂點應力均高于針刺組，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05)(表4)。

2.4.2 拉伸

各組大鼠股骨拉伸生物力學指標檢測見表5。

表5 股骨拉伸生物力學指標±s)Table 5 ±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與針刺組比較，#P<0.01

與對照組比較，阿侖膦酸鈉組和針刺組的最大值載荷、斷裂點載荷均增高，差異具有統計學意義(P<0.01)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，阿侖膦酸鈉組和針刺組最大值應力、斷裂點應力有均增高，差異具有統計學意義(P<0.01)；針刺組和阿侖膦酸鈉組比較差異有統計學意義(P<0.01)(表5)。

3 討論

骨質疏松癥在中醫學中將之歸于“骨痿”范疇，《素問·痿論》中記載：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”。其病因病機主要為腎虧、脾虛和骨枯。根據中醫學理論“腎主骨”、“脾主肌肉”、“骨會大杼”，我們選取了具有健脾益腎強骨作用的足三里、腎俞、大杼；根據其證型多為虛證，采用行針手法中的捻轉補法，并將這種用于治療骨質疏松癥的針刺治療方法稱為“健脾益腎強骨針法”。根據骨的生長代謝周期，將治療時間定為6個月。股骨骨折是骨質疏松癥一種嚴重的并發癥，它不僅導致功能喪失，而且有較高的致殘率和致死率。在我們前期關于骨質疏松癥研究的基礎上，在針刺治療6個月后，我們進行了在體股骨骨折最小外力、新鮮股骨骨形態學、骨密度和骨力學性能等測試，并探討了針刺療法對骨質疏松性股骨骨折的干預機制。

3.1 在體股骨骨折最小外力的測試

通過表1可以看出，與對照組相比，針刺組、阿侖膦酸鈉組在體股骨抗外力的作用增強。但這個結果不能表明是股骨的抗外力能力增強，因為還有皮毛和肌肉的作用。針刺增強了在體股骨抗外力的作用究竟是通過肌肉還是骨，亦或是兩者共同所起的作用？目前的研究主要是集中在對離體股骨的檢測上，在體股骨抗骨折能力檢測應是今后研究針刺防治骨質疏松癥的一個方向。

3.2 新鮮股骨骨形態學測試

骨是有生命的器官，這是它同工程材料相比最大的特點，為了適應不斷變化的力學環境，骨在不斷地進行結構的優化和重建，骨具有功能適應性，即：骨總是以最少的材料，最合理的形狀、尺寸和最佳的材料成分比來承擔最大的載荷。根據Wolff定律：骨的生長、吸收、重建都與骨的受力狀態有關。通過表2可以看出，與對照組相比，針刺能夠促進股骨適應性形態學的改變，近端股骨頭橫徑變小，表明其受力，從力學的角度來講，發生骨折的可能性變小。反映了股骨作為有生命的器官適應性力學結構的改變。

3.3 骨密度

骨密度(BMD)能間接反映骨量多少，是目前用于診斷骨質疏松癥、預測脆性骨折風險的最佳定量指標[8]。何勁等[9]研究發現，針刺可在一定程度上提高骨密度。通過表3可以看出，與對照組相比，針刺能夠提高骨質疏松癥模型大鼠股骨密度。針刺可以在一定程度上提高骨密度，其臨床作用機制可能是針刺一方面通過對局部穴位的刺激，改善局部血液循環，同時通過對機體各系統、器官的生理、病理狀態進行影響和調整，維持內環境的穩定，從多種途徑阻止OP的發展，體現了針刺法對機體的影響是整體全面的調節。

3.4 力學性能

骨生物力學是對骨質進行評價的可靠方法[10]，生物力學參數是評價骨質疏松的重要指標[11]。李晶等[12]研究發現針刺與艾灸對去勢后大鼠的骨生物力學指標有良性調整作用。針刺可以提高SAMP6小鼠股骨最大載荷量、彈性載荷和彈性撓度，增強骨的強度[13]。通過表4、表5可以看出，與對照組相比，針刺能升高股骨最大值載荷、最大值應力、斷裂點載荷、斷裂點應力。

4 結論與展望

“健脾益腎強骨針法”具有預防絕經后骨質疏松癥模型大鼠股骨骨折的作用。其作用機制可能與針刺促進股骨的形態適應，提高骨密度，增加股骨的抗拉伸能力以提高股骨的抗外力性能相關。針刺療法與阿侖膦酸鈉均能提高實驗性骨質疏松大鼠在體股骨骨折最小外力，但針刺療法的作用機制與阿侖膦酸鈉不完全相同。針刺療法預防絕經后骨質疏松癥模型大鼠股骨骨折的作用可能還與針刺療法對肌肉的影響有關。在體股骨抗骨折能力檢測應是今后研究針刺防治骨質疏松癥的一個方向。同時，大鼠不能像人類一樣直立行走，股骨受力狀態與人類有較大差異，此研究結果能否為臨床防治骨質疏松性股骨骨折提供依據，仍需要更多的證據。