健骨顆粒對ER表達沉默成骨細胞株ROS1728的分化的研究

林煜 肖莉莉 林焱斌 張怡元 黃云梅 吳銀生 林燕萍*

1. 廈門大學附屬福州第二醫院骨科，福建 福州 350007 2. 福建中醫藥大學，福建 福州 350102

骨質疏松(osteoporosis)是一種常見的與年齡、性激素相關的退行性疾病，機體在達到骨峰值后，隨著年齡的增長、性激素水平的降低，成骨細胞活性逐漸降低，而破骨細胞活性相對增強，導致骨吸收大于骨形成，骨量減少。因此，骨質疏松是與衰老密切相關性疾病，而端粒酶在衰老過程中起著關鍵作用。端粒酶是一種特異的染色體末端轉移酶，能以自身RNA為模板，合成端粒DNA并加到染色體末端，使端粒延長，從而延長細胞的壽命甚至使其永生化[1]。端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是端粒酶活性的決定因素，TERT表達與端粒酶活性高度相關，能激活端粒酶抑制端粒DNA的消耗[2]。端粒、端粒酶調節機制與機體雌激素水平的關系十分密切，研究證實，雌激素主要作用于TERT基因的啟動子，對TERT轉錄水平進行調節而激活端粒酶[3]。前期研究顯示：成人男性和女性骨組織中TERT、雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)均會隨著年齡的增加逐漸下降[4]。而以補腎健脾立法的健骨顆粒，能明顯提高大鼠體內雌二醇(estradiol，E2)水平，促進成骨細胞的增殖和分化，提高細胞的代謝活力，延緩成骨細胞的凋亡，改善骨組織結構，達到防治骨質疏松的目的[5-8]。因此，本研究擬采用采用補腎健脾中藥健骨顆粒干預不同性別不同年齡老年鼠，從雌激素調節TERT活性角度探討健骨顆粒防治骨衰老機制的可能機制，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物

健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥味組成，原藥材統一由福建省醫藥公司提供，福建中醫藥研究院中試車間負責加工制備，每克顆粒含原生藥2.9 g。

1.2 實驗細胞及動物

成骨細胞株ROS1728(由中科院上海細胞庫提供)，3月齡清潔級雄性SD大鼠20只(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)用于制備含藥血清。

1.3 實驗試劑

低糖DMEM培養基、小牛血清、青/鏈霉素(新西蘭Hyclone公司產品)，細胞堿性磷酸酶(AKP)染色試劑盒、ALP、BGP、 ColⅠ酶聯免疫吸附測試試劑盒(上海西唐公司)，TRIZOL(MBI Fermentas公司)，PCR引物(博尚生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaqTMPCR Kit(日本TaKaRa公司)。ERα、TERT、c-MYC抗體(德國Calbiochem公司)；β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)；WesternBreeze(美國invitrogen公司)；PVDF膜(Amersham公司)。

1.4 主要實驗儀器

二氧化碳恒溫培養箱(BB16/BB5060型，德國Heraus公司)，Olympus倒置相差顯微鏡(日本TKO光學儀器株式會社)，Du650紫外分光光度計(美國Beckman公司)，BT224半自動生化分析儀(意大利生物技術公司)，9600DNA擴增儀(美國PE生物系統公司)，7500型實時定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 ER抑制的大鼠成骨細胞株ROS1728細胞模型的建立：于37℃、5%的CO2培養箱中培養。細胞傳代24 h后加藥，藥物(ICI182780) 溶解于二甲亞楓(DMSO)，終濃度為1×105mol/L。加藥60 h后取細胞，采用Western Blot法檢測干預后細胞中ERα的表達。

1.5.2 含藥血清制備：取3月齡清潔級雄性SD大鼠30只，分別喂服健骨顆粒、生理鹽水、雌二醇連續灌胃7 d，于最后1次灌胃后1 h腹主動脈無菌取血，常溫下靜置60 min，3000 r/min離心10 min后取同組血清混合，再離心1次，56℃滅活30 min，過濾除菌，-20℃保存備用。

1.5.3 分組：將ER抑制的大鼠成骨細胞株ROS1728細胞以1×105/mL傳代接種于培養皿、培養瓶或培養板中，加入不含小牛血清的單純DMEM培養基，饑餓24 h，使細胞同步化于G0或G1期，對照組為正常ROS1728細胞加入最佳濃度的生理鹽水血清，模型組為ER抑制的ROS1728細胞模型，藥物刺激組在ER抑制的ROS1728細胞加入最佳濃度的健骨顆粒顆粒含藥血清，雌激素組在ER抑制的ROS1728細胞加入最佳濃度的雌二醇含藥血清。

1.5.4 成骨細胞分泌ALP、BGP、 ColⅠ的測定：分別按各試劑盒說明書。

1.5.5 實時熒光定量SYBR GREEN法檢測ERE、ERα、c-MYC、P53、Pot1、NF-κBmRNA的表達：收集連續培養3d細胞，采用實時熒光相對定量SYBR GREEN法檢測。ERE引物：ERE引物序列：上游引物F：5’-AAGGAGCACCTCTCAAACC-3’，下游引物R：5’-AAATGGACTACAGCCGCTT-3’，產物長度：189bp；ERα引物序列：上游引物F：5’-ACCTCAAGATGTGCCACTC-3’，下游引物R：5’-TGCTCTCTCCAAACCAGAC-3’，產物長度：197bp； c-MYC的引物序列：上游引物F：5’-CTGATGAAGGAACCTCTGAGTT-3’ 下游引物R：5’-CTGACAGTTGATGCGAGTG-3’，產物長度：189bp；內參β-actin引物：上游5‘AGGCTGTGTTGT CCCTGTA3’，下游5‘ ATGTCACGCACGATTTCC3’，產物長度 193bp。采用Trizol法提取總RNA，抽提后的RNA加入溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果通過凝膠圖像分析系統對條帶進行分析；檢驗RNA無降解，測定RNA的吸光度值，計算出RNA的濃度，在根據濃度計算出體積后取RNA 500ng按試劑盒步驟進行反轉錄。反轉錄后在ABI7500上按照試劑說明進行mRNA擴增，得到擴增曲線與CT值。將得到的各組目的基因及β-actin基因的值分別代入各自的標準曲線，換算出各自的起始模板量。以β-actin作為參比基因對所有樣品進行RNA校正，用待測基因的定量結果除以β-actin定量結果即可得到校正值。以陰性對照組mRNA的表達量作為“1”，再根據校正值計算出其他各組的相對量，進行組間相對量的比較。

1.5.6 Western Blot 檢測TERT、ERα、c-MYC蛋白的表達：提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以每泳道30μg蛋白上樣，進行12%十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS - PAGE), 電轉移將膠上蛋白轉印至PVDF膜。膜以封閉液室溫封閉30 min。將與目的蛋白融合表達的標簽抗體1∶5 000稀釋，封閉膜1 h。每次 40 mL 洗液漂洗膜6次，即：1 min 2 次；20 min 2 次；5 min 2 次。然后將堿性磷酸酶標記的二抗室溫封閉膜30 min，然后如前洗膜。將 AP化學發光底物與膜室溫下孵育反應5 min，暗室中壓X片曝光、顯影。應用Phoretix 1D生物電泳圖象分析系統分析膠片中的目的條帶，計算機自動讀取并記錄每條帶的光密度值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 Western Blot 檢測ER抑制的大鼠成骨細胞株ROS1728細胞模型的是否建立

用ICI182780干預ROS1728細胞后，Western blot分析目的蛋白的表達發現：模型組ERα表達呈陰性，而正常ROS1728細胞表達呈陽性，組間比較均有顯著性差異(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組ERα蛋白表達1-正常ROS1728細胞組；2-模型組Fig.1 Expression of ER protein in each group

2.2 不同濃度含藥血清促成骨細胞增殖

AlamarBlue檢測繪制成骨細胞增殖曲線圖，生理鹽水血清組細胞隨血清濃度增加增殖速度改變不明顯，當濃度達到50%時，細胞增殖明顯降低；健骨顆粒血清組細胞隨血清濃度增加而增殖加快，并在含藥血清濃度為20%時增殖速度最快；雌激素血清組細胞隨血清濃度增加而增殖加快，并在含藥血清濃度為35%時增殖速度最快；兩組與同濃度生理鹽水血清組比較差異有統計學意義(P<0.05)，隨后隨著血清濃度繼續增加，其增殖速度下降(見圖2)。因此確定20%健骨顆粒血清、35%雌激素血清組為促成骨細胞增殖最佳濃度。

圖2 不同濃度不同組別血清對ROS1728增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of serum on the proliferation of ROS1728 cells

2.3 細胞培養液中ALP、BGP、ColⅠ等信號因子的表達

采用不同血清干預成骨細胞后，ELISA法分析細胞液中的ALP、BGP、 ColⅠ發現：隨著干預時間的延長，培養液中的三種信號因子的含量逐漸上升，各組內不同天數比較差異無統計學意義(P>0.05)。而組間比較顯示：對照組3種信號因子的水平最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低，各組比較有顯著性差異(P<0.05)。(見表1-3)

表1 4組成骨細胞培養液中ALP的含量(μg/mL) Table 4 Content of ALP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

表2 4組成骨細胞培養液中BGP的含量 μg/mLTable 2 Content of BGP in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

表3 4組成骨細胞培養液中ColⅠ的含量(μg/mL)Table 3 Content of Col I in osteoblast culture medium in the 4 groups (μg/mL)

注：與同期模型組比較，aP<0.05；與同期健骨顆粒組比較，bP<0.05；與同期雌激素組比較，cP<0.05；與同期對照組比較，dP<0.05

2.4 各組細胞中ERE、ERα、c-MYC基因表達

qPCR結果表明：健骨顆粒組及雌激素組的ERE、ERα、c-MYC、的RNA的表達均高于模型組，但低于對照組，且雌激素組的ERE、ERα、c-MYC表達高于健骨顆粒組，各組間比較差異有統計學意義(P<0.01)(見表4)。

表4 各組細胞中ERE、ERα、c-MYC的mRNA的表達結果±s)Table 4 mRNA expression of ERE, ER, and c-MYC ±s)

注：a與模型組比較，P<0.01；b與健骨顆粒組比較，P<0.01；c與雌激素組比較，P<0.01；d與對照組比較，P<0.01

2.5 各組細胞中TERT、ERα、c-MYC蛋白表達

4組TERT、ERα、c-MYC蛋白表達量情況以對照組的蛋白表達含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低。各組比較均有統計學意義(P<0.05)(詳見圖3)。

圖3 各組TERT、ERα、c-MYC蛋白表達1-模型組，2-健骨顆粒組，3-雌激素組，4-對照組Fig.3 Expression of TERT, ER, and c-MYC protein in each group

3 討論

端粒酶是一種具有特殊逆轉錄酶活性的核糖核蛋白復合物，能保證染色體結構的穩定性和完整性、防止細胞的衰老和凋亡。而TERT是端粒酶起作用的關鍵結構，可通過逆轉錄端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重復序列并添加到染色體末端，從而延長端粒長度。在TERT 啟動子序列上有兩個雌激素反應元件(ERE)通過雌激素受體α(ERα) 結合TERT基因啟動子區域的ERE，激活TERTmRNA的轉錄進行[9-11]。在表達ER的細胞中，雌激素可與胞質內的ER結合，通過ERE直接激活端粒酶逆轉錄酶的表達[12]。此外在增齡性衰老過程中，TNF-α 基因表達和活性的抑制也與衰老具有時間相關性：TNF-α可通過端粒酶依賴機制，直接損傷DNA導致的端粒紊亂，降低端粒酶的活性導致端粒損傷來誘導細胞衰老、凋亡[13]；另外TNF-α可以通過誘導與NF-κB結合的TERT蛋白，由細胞漿轉移到細胞核來調節端粒酶的活性。NF-κB被TNF-α激活后，調節其下游的靶點TERT，抑制其活性[14,15]。因此隨著衰老、性腺功能降低，體內雌激素水平的下降導致TERT水平的降低，使骨組織中ER表達陽性的成骨細胞功能衰退，骨形成低于骨吸收，從而導致骨質疏松的發生。本實驗采用ERα特異性抑制劑ICI182780阻斷ROS1728細胞ERα表達后，模型組TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，同時模型組細胞中ALP、BGP、ColⅠ的含量也低于對照組，表明ER介導的TERT信號通路與成骨細胞功能衰退密切相關。

補腎健脾中藥健骨顆粒是針對骨質疏松“腎虧脾虛”的病機特點，以“腎主骨”、“補先后天”理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥物。方中煅狗骨味甘，性溫，功能補益肝腎、活血通絡；淫羊藿味辛甘，性溫，與煅狗骨共奏補腎益精，強筋健骨之效。山茱萸味酸澀，性微溫，酸澀主水，溫能助陽，故能柔潤助陰，補益肝腎，滋養精血而助元陽之不足，進一步增強煅狗骨、淫羊藿之補腎益精。黨參、山藥健脾益氣，使氣血生化有源，氣旺則精足，精足則髓充，髓充則骨養，為腎中精氣的充養提供來源。諸藥合用，可通過補腎健脾，達到強筋壯骨之目的。在使用健骨顆粒含藥血清后，隨著干預時間的延長，培養液中的ALP、BGP、ColⅠ的含量逐漸上升。其中對照組3種信號因子的含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低(P<0.05)。4組TERT、ERα、c-MYCmRNA及蛋白表達量情況以對照組的蛋白表達含量最高，雌激素組次之，健骨顆粒組再次之，模型組最低(P<0.05)。提示健骨顆粒通過補腎健脾，調節機體雌激素水平，提高成骨細胞ERα的表達，從而使TERT表達增強，提升了成骨細胞活性和功能，抑制成骨細胞的凋亡，促進骨重建過程中骨形成量的增加。

總之，健骨顆粒是通過影響雌激素介導的TERT及其相關因子的變化，從而促進成骨細胞分化及延緩細胞凋亡，是有效防治絕經后骨質疏松癥的一個重要環節。