髖骨性關節炎滑膜組織中鈣結合蛋白(S100A12)的表達及意義

代鳳雷 孫強 張斌 金雯 陳榮國 錢建吉

1. 揚州大學醫學院附屬六合醫院骨科，南京 211500 2. 南京市第一醫院骨科，南京 210006 3. 揚州大學醫學院附屬六合醫院病理科，南京 211500 4. 南京市中醫院骨傷科，南京 210006

髖骨關節炎(osteoarthritis，OA) 是一種由多種因素引起的老年人的慢性退行性骨關節疾病，是最常見的關節炎類型之一。髖骨關節炎的病理機制尚不完全清楚，近年來大量研究發現，致炎物質及免疫因子與骨關節炎癥密切相關。在OA 的早期, 滑膜的增生和纖維化, 分泌炎癥介質和軟骨降解酶, 可能是OA 發病的重要因素, 隨著OA 的進一步發展, 滑膜始終參與其病理過程。鈣結合蛋白(S100A12)在多種炎性反應中如類風濕關節炎，潰瘍性結腸炎和多種腫瘤等都有高的血清反應[1-4]，是與多數炎癥疾病相關的蛋白。在本研究中，我們的目的是檢測鈣結合蛋白S100A12在髖關節骨性關節炎滑膜組織中的表達，并分析其與髖骨性關節炎嚴重程度的相關性，以評估它在OA的發病中的作用。

1 材料和方法

1.1 對象

2014年6月至2016年4月，我院聯合南京市第一醫院骨科收治的行關節置換的髖骨性關節炎患者為實驗組(OA組)， 共27例，男15例，女12例，平均年齡61歲；對照組為外傷所致股骨頸骨折患者35例，男21例，女14例，平均年齡59歲。股骨頸骨折均行關節置換手術，術前結合病史及影像學檢查排除骨性關節炎病變。兩組患者術前行髖關節X線及CT檢查，明確診斷。納入患者得到患者本人同意及醫院倫理委員會批準。參照美國風濕病學會1995年提出的診斷標準：①近1月反復髖關節疼痛；②血沉≤ 20 mm/h；③ X 線片示骨贅形成，髖臼緣增生；④ X 線片示髖關節間隙狹窄。滿足①+②+③條或①+③+④條者可診斷髖關節退行性骨關節炎。對OA組患者的髖關節X片分析，根據Kellgren-Lawrence(K-L)分期標準，將27例OA組患者劃分： 3 級16 例，4 級11 例。排除標準：其他原因導致的髖關節病變如類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、感染等；治療前2 w內使用過糖皮質類固醇激素的患者；半年內行關節腔內注射；合并嚴重的系統疾病以及神經、精神障礙者。

1.2 方法

血清標本的采集: 患者禁食12 h，取靜脈血，除送檢血常規、ASO、RF、CRP外，4℃下2000 g 離心10 min后取上清貯存于-80℃冰箱內備用。手術標本的采集：髖關節置換術中暴露關節滑膜，按同一規格，同一部位，切取0.5 cm0.5 cm滑膜，生理鹽水反復沖洗標本表面血跡后放入消毒凍存的EP管內，-80℃冰箱保存備用；免疫組化測定標本立即放入4%多聚甲醛液固定, 經脫水、透明、石蠟包埋, 免疫組化備用。

ELISA 試劑盒為S100A12 Elisa 試劑盒及S100A12多克隆抗體由美國Abnove 公司提供，BCA 試劑盒、裂解液及二抗由南京碧云天生物技術研究所提供。

ELISA法測血清S100A12含量：S100A12濃度的定量測定采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，使用ELISA試劑盒并按試劑盒說明書執行(S100A12/EN-RAGE ELISA Kit，Cat no: KOA091 V.04，美國Abnove 公司)。S100A12 蛋白標準液用前24h內配制；取0.1 mL的蛋白標準工作液于孔板中；0.1 mL 樣品稀釋液于“0”孔中，做空白對照；取樣品上清50 μL 加入50μL 的樣品稀釋液于空的孔中；加蓋，37℃，90 min，孵育；孵育結束，去掉孔板上的液體；取0.1 mL 抗體工作液于每孔中，37℃，60 min，孵育；PBS 洗板3 次，去掉液體；取0.1 mL 稀釋后的ABC 工作液于每孔，37℃，30 min，孵育。PBS洗板5 次，去掉孔板上的液體；加入90 μL TMB顯色液，37℃，30 min，孵育；加100 μL TMB 終止液于每孔中，30 min內酶標儀(美國BIO-RAD公司)測定A450的OD值。根據標準曲線計算出樣品的蛋白含量。實際S100A12 濃度應為測試結果乘以稀釋倍數。

ELISA法測滑膜組織S100A12含量：將滑膜組織標本自然解凍后，切成細小的碎片，置于離心管中，向每個離心管中加入200 μL的預配置的裂解液，冰上裂解1h，組織勻漿離心(10000 g，4℃，15 min)，取上清。BCA法測定總蛋白的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明。反應結束半小時內酶標儀測定A562的OD值。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。ELISA測滑膜組織S100A12含量，步驟按試劑盒說明嚴格執行；加終止液后30 min內酶標儀測定A450的OD值，根據標準曲線計算出樣品的蛋白含量。計算每一總蛋白濃度中S100A12含量，單位為ng/mg總蛋白。

免疫組化標本的采集及染色：蠟塊3 μm連續切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法 (streptavidin-perosidase，SP) 法進行免疫組化染色。常規二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。3% H2O2清除內源性過氧化物酶，置于pH6.0的檸檬酸鈉修復液，微波加熱修復；10%正常山羊血清封閉，室溫20 min，甩去多余液體；加入一抗，4℃過夜，用PBS緩沖液代替抗體作空白對照；生物素標記的二抗孵育；加辣根酶標記鏈霉卵白素原液(1∶300)，孵育30 min。DAB顯色30 min。常規蘇木素復染，梯度酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察，拍照(×400)。結果判定標準：陽性細胞指細胞質或細胞膜內出現棕黃色顆粒。每張切片在顯微鏡下隨機選擇5個高倍視野，染色程度進行半定量分析，采用Image Pro Plus 6.0(IPP)軟件對片進行灰度分析，計算陽性反應的平均光密度值(mean optic density，MOD)，MOD=積分光密度/面積。

1.3 統計學處理

2 結果

OA組患者年齡(61.9±6.34)歲和對照組(59.6±14.7)歲之間無顯著的年齡差異(P=0.18)，兩組之間性別差異不顯著(P=0.80)。見表1。

獨立樣本T檢驗，OA組的血清中S100A12水平(94.20±49.85)ng/mL顯著高于對照組含量(25.32±16.87)ng/mL，差異有統計學意義(P<0.01)。滑膜組織OA組與對照組S100A12含量分別為(3.73±1.97)ng/mg總蛋白和(1.67±1.21)ng/mg總蛋白(P<0.01)，差異有統計學意義。

OA組K-L分級4級患者的血清中S100A12水平(104.81±46.68)ng/mL顯著高于3級血清含量(86.85±52.46)ng/mL，有統計學差異(P<0.01)。4級患者滑膜組織含量(4.62±1.95)ng/mg總蛋白顯著高于3級患者水平(3.13±1.82)ng/mg總蛋白(P<0.01)。4級患者滑膜組織MOD (0.23±0.06)高于3級患者MOD(0.20±0.06)，但無顯著統計學意義(P=0.30)。

免疫組化分析S100A12表達水平，陽性反應在微血管內中性粒細胞胞漿中，以及部分滑膜細胞的胞漿內。兩組S100A12 均表達，OA組平均光密度MOD(0.21±0.06)較對照組MOD(0.13±0.05)有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化圖片見圖1，2。

使用Pearson 相關分析滑膜組織含量與血清含量無顯著相關性(r=0.378，P=0.083)；滑膜組織含量與免疫組化MOD顯著正相關性(r=0.43，P=0.048)，但相關關系不密切。血清含量與免疫組化MOD無顯著相關性(P>0.05)。

表1 OA組與對照組一般情況比較±s)Table 1 Comparison of general data between OA and ±s)

圖1 OA組滑膜免疫組化Fig.1 Immunohistochemical results in OA group

圖2 對照組免疫組化Fig.2 Immunohistochemical results in control group

3 討論

S100A12是近年來新發現的一種促炎因子，參與機體的免疫防御和炎癥反應，在炎癥發應中起關鍵作用，具有調節細胞生長分化、生長抑制、并誘導細胞凋亡等[5]。促炎因子S100A12鈣結合蛋白家族中的一員，與鈣離子的親和力較高，在其他炎癥介質刺激后，發生蛋白構象的改變，由此暴露靶蛋白結合位點，能夠與特異性的蛋白或肽類結合，發揮生物學功能。這些鈣結合蛋白控制一些關鍵細胞通路，如細胞骨架，細胞的遷移與粘附，主動氧化防御，參與傷口的愈合，炎性細胞的激活、化學趨化和抗微生物作用，代謝性及腫瘤性疾病的病理生理過程[6,7]。

髖關節骨性關節炎是一種老年患者常見病，髖關節是人體主要的負重關節，容易勞損，多見于體重肥胖的老年人。該病起病緩慢，病程長，臨床表現為關節腫脹、關節疼痛、功能障礙，行走困難，嚴重影響了老年人的生活質量。髖骨關節炎的風險因素眾多，包括年齡、負重改變及外傷等。然而，其發病機制仍然不明確。

滑膜組織是指位于關節腔、滑液鞘及滑液囊腔最內面的內襯膜狀結構，其主要作用被認為是產生滑液, 降低關節、肌腱、肌肉活動過程中的摩擦阻力。雖然并非所有的OA 發病都與滑膜炎有關，但慢性滑膜炎的產生，可能是促進OA 進行性發展的關鍵環節，對滑膜組織病理的深入研究發現，關節滑膜分泌的炎性介質如金屬蛋白酶(MMP)、腫瘤壞死因子-A(TNF-A)、白細胞介素-1(IL- 1)、細胞間黏附分子-1(ICAM- 1)等可能參與了OA 的整個病變過程[8-9]。

本實驗研究顯示，髖關節OA患者血清及滑膜組織中的S100A12含量顯著高于對照組，說明S100A12對髖關節OA患者發病有重要影響。關節外組織及血液中分泌的S100A12進入血液循環系統，到達OA患者的關節周圍組織如滑膜，促進滑膜炎的產生；血液的中性粒細胞分泌的S100A12并未完全通過滑膜進入關節液，可能在轉運過程中受到滑膜屏障的限制。免疫組織化學檢測顯示，S100A12陽性染色不僅存在于滑膜組織細胞中，也存在于OA患者滑膜的微血管中，說明S100A12可以由關節外組織分泌經血液循環，通過滑膜屏障作用于關節軟骨，也可以在滑膜組織自身分泌，近距離更直接的發揮作用。

通過血液滑膜組織S100A12表達量的比較，S100A12經血液系統作用于關節比滑膜組織自分泌更有意義。進一步說明骨性關節炎是一種系統性疾病，其發生發展是關節自身損害與全身各系統病變相互作用的結果。

本實驗存在一定缺陷，實驗組髖OA患者較少，因為是臨床試驗，缺少健康對照組；髖骨性關節炎OA患者多為老年人，基礎病較多，對納入試驗的患者，不能將關節外病變完全排除，系統性疾病對檢測結果應有一定的影響；缺少對患者骨性關節炎的嚴重程度評級，不能完全說明S10012含量的變化對病情嚴重程度的相關性；缺少治療前后的檢測對比。

綜上所述，滑膜組織的S100A12的檢測對OA的診斷的靈敏度高于血清檢測。由于在多種疾病進程中S100A12被發現，如類風濕性關節炎、克羅恩腸炎、銀屑病、胰腺炎、腫瘤、肺炎，以及某些自身免疫性疾病，所以血清檢測S100A12對OA的診斷缺少特異性[10,11]。因此通過滑膜檢測S100A12，可將關節外病變對S100A12含量變化的影響降低，進而提高靈敏度；S100A12含量的檢測對早期診斷OA，評估OA的進展有益[12,13]。S100A12在OA患者的滑膜中表達；并且S100A12的表達與患者骨關節炎嚴重程度成正相關； S100A12的檢測有助于骨性關節炎的早期診斷，提示病變嚴重程度，為臨床治療提供參考。