護骨膠囊對去卵巢大鼠鈣相關激素和性腺激素影響的研究

林澤苗 鐘佳賢 賈歡歡 吳玉娥 陳珺 曹祺 曹克廣 李青南，*

1. 廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監測所，廣東 廣州 510663

絕經后骨質疏松癥是由于卵巢功能衰退，血內雌激素水平下降，致使骨吸收與骨形成加速，從而造成高轉換型骨量丟失，結果導致骨小梁斷裂、穿孔，皮質骨變薄，易于發生骨折的一種疾病[1-2]。去卵巢大鼠的雌激素水平下降，與人類絕經后的骨質疏松相似。

中藥復方護骨膠囊為廣東安諾藥業股份有限公司的產品，由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、骨碎補、杜仲、續斷、巴戟天、當歸和山藥等中藥根據中醫的君臣佐使原則組成。目前在臨床已廣泛應用于治療原發性骨質疏松癥。為深入探討其作用機理，本實驗采用護骨膠囊作用于去卵巢大鼠，觀察大鼠血清中與鈣代謝直接相關的激素和性激素及子宮的影響，以進一步闡明其預防骨質疏松癥的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與實驗環境

3月齡SPF級雌性 SD大鼠60只，體重(210±3)g (由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：NO.44007200017783)。飼養于廣東省實驗動物監測所，室溫為(25±2)℃，濕度為(60±2)%。任意進食大鼠標準飼料和飲水。

1.2 動物分組與造模

按隨機函數將大鼠分為6組：假手術組(Sham)；去卵巢組(OVX)；仙靈骨葆膠囊組(Pos)；護骨膠囊低劑量組(HG-L)；護骨膠囊中劑量組(HG-M)；護骨膠囊高劑量組(HG-H)。每組各10只。適應性喂養2w后,用2%戊巴比妥鈉，按45mg/kg 腹腔注射對大鼠進行麻醉，大鼠成功麻醉后，行雙側卵巢切除手術。假手術組按同法操作，僅摘除雙側卵巢周圍部分脂肪。

1.3 藥物及給藥方法

護骨膠囊由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續斷、骨碎補、當歸和山藥組成，由廣東安諾藥業股份有限公司生產，批準文號為藥準字Z20040124，批號為20150101，規格為0.45 g；仙靈骨葆膠囊(陽性藥物)由淫羊藿、續斷、補骨脂、知母、丹參和地黃組成，由貴州同濟堂制藥有限公司生產，批準文號為國藥準字Z20025337，批號為20140701，規格為0.50 g。仙靈骨葆膠囊組每天灌服人體等效劑量的仙靈骨葆膠囊0.270 g/(kg·10ml)。護骨膠囊低、中、高劑量組每天分別灌服0.243 g/(kg·10ml)、0.486 g/(kg·10ml)、0.972 g/(kg·10ml)。其中護骨膠囊中劑量組為人體等效劑量組。

1.4 主要試劑及儀器

試劑：石蠟、二甲苯、無水乙醇、鹽酸乙醇、TO生物型制片透明劑、蘇木精液、伊紅液、中性樹膠。儀器：Leica包埋機、Leica切片機、Leica碳化鎢鋼刀、Leica生物顯微鏡。

1.5 血清性激素的檢測

藥物干預結束時，心臟取血處死大鼠，將血液以3000 r/min離心20 min，分離出血清，送至上海邦奕生物科技有限公司，采用Elisa試劑盒檢測血清激素5項：1, 25雙羥維生素D3(1,25(OH)2D3)、甲狀旁腺激素(PTH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)。

1.6 子宮觀察

藥物干預結束時，心臟取血處死大鼠，取各組大鼠子宮，稱重后，進行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 OVX及HG對大鼠血清PTH和1,25(OH)2D3的影響

與Sham組比較，OVX組的PTH水平顯著升高(P<0.01)；與OVX組相比，PTH水平在HG-L、HG-M(P<0.01)和HG-H組(P<0.05)減少，HG-H組比HG-L、HG-M組顯著升高，Pos組與OVX組比差異無統計學意義(P>0.05)。HG各組均比Pos組降低(P<0.01、P<0.05)。1,25(OH)2D3在此實驗中差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實驗后血清激素指標的變化±s，ng/L)Table 1 Changes of serum hormone indexes in rats after ±s，ng/L)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

2.2 OVX及HG對大鼠血清E2、P和T的影響

與Sham組相比，OVX組的E2水平和P水平下降(P<0.01，P<0.05)，T水平升高(P<0.05)。與OVX組相比，E2水平在HG-L和HG-M組增加(P<0.01)，HG-H組無統計學意義，但HG-H組較HG-L、HG-M組下降(P<0.05)。Pos組與OVX組比較差異無統計學意義。HG-L和HG-M組的E2較Pos顯著升高；P水平在Pos組顯著性升高(P<0.01)，在HG-L組減少(P<0.05)，HG-M組和HG-H組無變化。T水平在HG-L組和HG-H組無變化，HG-M組減少(P<0.01)，在Pos組顯著性升高(P<0.01)。見表2。

2.3 OVX及HG對大鼠子宮的影響

Sham組、OVX組、Pos組、HG-L組、HG-M組、HG-H組的子宮重量分別是(0.670±0.19)g、(0.103±0.04)g、(0.097±0.02)g、(0.113±0.04)g、(0.112±0.02)g、(0.114±0.06)g。其中，與Sham組比較，各組的子宮重量均顯著減少(P<0.01)。藥物組的子宮重量與OVX組比無變化。

表2 各組大鼠實驗后血清性激素指標的變化±s)Table 2 Changes of serum sex hormone indexes in rats after the experiment(±s)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05,0.01 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

Sham組的子宮內膜上皮細胞肥厚，腔大，無明顯增厚及增生；與Sham組比較，OVX組子宮萎縮變小，宮腔變小，子宮內膜上皮細胞萎縮；與OVX組比較，HG-L和HG-M組無明顯差異，HG-H組內膜稍增厚。Pos組無明顯差異。見圖1。

圖1 各組大鼠實驗后子宮切片(HE染色)。A：假手術組(5×)；B：去卵巢組(5×)；C：仙靈骨葆膠囊組(5×)；D：護骨膠囊低劑量組(5×)；E：護骨膠囊低中量組(5×)；F：護骨膠囊低高量組(5×)Fig.1 The rats uterus slices after the experiment(HE dyeing). A: Sham(5×);B:OVX(5×);C: Pos(5×);D:HG-L(5×);E:HG-M(5×);F:HG-H(5×)

3 討論

3.1 血清PTH和1,25(OH)2D3分析

PTH和1,25(OH)2D3是調節體內鈣、磷系統平衡的兩大主要激素[3-4]。本實驗OVX組PTH水平升高，可能是因為大鼠去卵巢后，E2水平下降所導致。研究表明[5]，E2分泌下降，會使骨骼中的鈣結合力降低，刺激PTH的分泌，PTH激發升高，作用于骨組織，使間質細胞向破骨細胞轉化，促進破骨細胞吸收，使骨鈣釋放入血，導致骨質疏松[6]。而HG各劑量組的PTH水平顯著降低，這與補腎化瘀壯骨湯[7]、鹿銜草[8]等對去卵巢大鼠的研究結果一致。提示護骨膠囊能調節去卵巢后的PTH分泌失常。Pos組的PTH水平與OVX組差異無統計學意義，說明仙靈骨葆膠囊不調節PTH，這與趙小梅[9]對仙靈骨葆膠囊的研究一致。而實驗各組的1,25(OH)2D3差異均無統計學意義，此結果說明OVX與藥物不是通過血清中的1,25(OH)2D3起作用的。

3.2 血清E2、P和T分析

E2主要由卵巢、黃體和胎盤產生，肝、腎上腺皮質及乳房等也能產生少量E2，它是影響雌性動物生殖系統生長發育，維持雌性性機能的重要類固醇激素[10]。當雌激素缺乏時會引起明顯的骨量丟失，骨結構退變以及骨高轉換等骨質疏松癥狀[11]。本實驗中，OVX組E2水平顯著降低，HG-L和HG-M組則顯著升高，HG-H組E2水平也升高，但與OVX組比差異無統計學意義。說明護骨膠囊具有補充性激素的作用，能調節去卵巢造成的E2分泌下降，這可能是因為護骨膠囊藥物組成里的淫羊藿、制何首烏和骨碎補等補腎中藥含有植物雌激素。植物雌激素的研究已越來越受到重視。劉仕杰等[12]發現淫羊藿可提高OVX大鼠血清雌激素水平。楊利娟[13]通過雌激素受體(ERα/β)對靶基因的轉錄調節作用，證明了何首烏的主要活性成分大黃素、骨碎補中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷都具有顯著的植物雌激素作用，說明護骨膠囊能產生植物雌激素樣作用。Pos組的E2水平與OVX組比差異無統計學意義，說明仙靈骨葆膠囊不調節血清E2。這與趙小梅[9]對仙靈骨葆膠囊的研究結果一致。

P是重要的甾體激素，主要在卵巢黃體的顆粒細胞、胎盤的合體滋養層細胞合成[14]。研究發現P能誘導成骨細胞TGF-β1、TGF-β2的表達，促進成骨細胞增殖與分化、增強成骨功能及骨基質合成，促進骨形成[15]。本研究OVX組P水平降低，這與羅曉冰等[16]對OVX大鼠的研究結果一致。服用護骨膠囊后，大鼠血清P水平不升高，這可能是因為E2能與P競爭性激素結合球蛋白上的結合位點，故游離的E2水平升高，P不升高[17]。Pos組P水平顯著升高，提示仙靈骨葆膠囊通過P促進成骨的作用。

T具有促進骨形成與鈣磷沉積的作用，可直接作用于成骨細胞，還可通過轉化為E2間接起作用[18]。P、T和E2均為甾體激素，在體內可以通過中間體雄烯二酮進行P→T→E2的轉化[19]。研究發現，絕經后婦女E2主要來自于腎上腺皮質分泌的T在體內的轉變[20]。故OVX組T升高，可能是由于去卵巢后E2下降，刺激T分泌。與OVX組比，T水平在HG-L和HG-H組無變化；在HG-M組降低，但與Sham組水平相當，具體原因有待深入研究；仙靈骨葆膠囊的T水平在OVX組的基礎上顯著升高。有研究表明：T既能增加骨細胞的增生、分化，又能增加堿性磷酸酶的活性而起成骨作用[21]。本研究的結果說明仙靈骨葆膠囊通過T促進成骨的作用。

3.3 OVX及HG對大鼠子宮的影響

大鼠切除卵巢后，子宮明顯萎縮。卵巢的功能之一是分泌雌激素，維持子宮功能，雌激素與孕激素等共同作用于子宮內膜[22]。故大鼠切除卵巢后，OVX組E2減少，子宮內膜變薄，子宮萎縮變小，提示造模成功。護骨膠囊能顯著增加血清E2水平，但子宮與OVX組比較差異無統計學意義，僅高劑量使子宮內膜稍增加。其原因可能是護骨膠囊含有的成分為植物雌激素，對子宮的影響很小。這與西藥雌激素的作用不同，研究發現，長期補充外源性的西藥雌激素，易導致子宮內膜增生，水鈉潴留，嚴重的還會出現子宮內膜癌、乳腺癌、血栓栓塞等不良反應[23]。

綜上所述，護骨膠囊能降低去卵巢大鼠血清的PTH水平，升高E2水平，說明護骨膠囊能調節與鈣代謝直接相關的激素，同時又具有調節和補充雌激素的作用，且對子宮影響不大。該研究提示護骨膠囊對絕經后骨質疏松的治療機理可能是通過調節血清中的 PTH和E2的水平，為推廣護骨膠囊臨床防治絕經后骨質疏松提供了實驗依據。