石河子地區中老年人群LRP5基因Q89R位點多態性與骨質疏松的關聯性分析

陳福宇 李海濤 孟德峰 張蕾 史晨輝 王維山*

1. 石河子大學醫學院第一附屬醫院骨科，新疆 石河子 832002 2. 石河子大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，新疆 石河子 832002

LRP5基因存在于染色體11q13區,包含23個編碼外顯子，編碼1615個氨基酸組成的蛋白質,是骨形成和成骨細胞增殖的重要調節子[1]。LRP5基因功能缺失性突變(G171V)導致一種常染色隱性遺傳性疾病,具有眼發育異常、兒童期骨折、低骨量的特點,稱為骨質疏松-假神經膠質瘤綜合征[2]。Little等[3]的研究提示胞外區第一個β-螺旋結構內的點突變改變局部疏水環境從而可能影響LRP5和其他蛋白質之間的相互作用，因而推測LRP5基因Q89R多態性位點可能通過改變LRP5蛋白質功能而影響了骨密度。由于新疆遠離內陸地區，氣候、飲食等與內陸有一定的差別，且漢族人口為中東部不同省份遷入，目前尚無針對新疆地區漢族人群LRP5基因Q89R位點基因頻率的相關文獻報道，因此本研究旨在探討石河子地區中老年人群LRP5基因Q89R位點與骨質疏松的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究選取2015年6月至2016年5月在新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院骨科住院的漢族45歲及以上的中老年病人作為研究對象。納入對象排除嚴重肝腎疾患、骨代謝相關疾病(糖尿病、甲狀腺功能亢進、風濕性關節炎等)病史，無半年內服用影響骨代謝藥物的藥物史。本研究根據骨密度情況將研究對象分為三組：骨質疏松組、骨量低下組、骨量正常組。

1.2 研究方法

1.2.1采集標本：血液標本采集研究對象均空腹12～14 h，抽取肘正中靜脈血6 mL置于EDTA抗凝管中，Thermo -80 ℃冰箱保存；取靜脈血4 mL置于肝素抗凝管中，1 h內2 500 r/min離心10 min，取上層血清用于生化指標的檢測。

1.2.2提取DNA：取全血1 mL,試劑盒法(天根公司血液基因組DNA提取試劑盒，TIANamp Blood DNA Kit，離心柱型)提取基因組DNA。取4 μL DNA產物與1 μL loading buffer(天根公司)混合，經1%瓊脂糖凝膠電泳,Goldview染色,使用凝膠成像儀(Bio-rad公司)觀察DNA提取是否成功。

1.2.3聚合酶鏈反應：LRP5基因Q89R位點引物按參考文獻設計[4]，序列為Upstream primer：5’-TCTGGGCATAGTGCTCCATC-3’；Downstream primer：5’-TTCCGGGATGTGCCATTGAG-3’。反應體系為25 μL，其中含Thermo Mix 12.5 μL；三蒸水9.5 μL；上游引物、下游引物各0.5 μL；模板DNA2 μL。置于PCR儀(日本Takala公司)中95 ℃預變性7 min，按下列程序循環34次，即95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃最終延伸10 min。取5 μL PCR產物，經1.5%瓊脂糖凝膠(Goldview染色)電泳，使用凝膠成像儀(Bio-Rad公司)觀察擴增是否成功。

1.2.4限制性酶切：PCR擴增產物10 μL(約0.3 μg)直接用1U Ava Ⅱ 酶切(快酶，Thermo公司生產)反應體系共30 μL(1 μL enzyme、Tango buffer、water、10 μL PCR product),溫度為37℃,反應時間為20 min。酶切反應終止后,產物經1.5%瓊脂糖凝膠(Goldview染色)電泳,以DNA marker(DNA片段的分子量為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp的DNA片段)作為參考,凝膠成像儀(Bio-Rad公司)下觀察結果并成像保存。

1.2.5基因測序：PCR產物由3730XL測序儀(北京六合華大基因科技股份有限公司)測定，并使用Chromas軟件分析，結果見圖4。

1.2.6生化指標的測定：采用日立7170全自動生化分析儀測定堿性磷酸酶(AKP)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白A(APO-A)、鈣(Ca)、磷(P)在血液中的濃度。

1.2.7骨密度(BMD)的測定：應用雙能X線骨密度測量儀(美國GE公司LUNAR雙能X線骨密度儀，石河子大學醫院第一附屬醫院骨密度室)檢測BMD(單位為g/cm2)，測定受試者腰椎第一節、腰椎第二節、腰椎第三節、腰椎第四節、股骨頸(FN)、大轉子(Troch)和Ward’s三角區、股骨干(FS)的BMD值。每日測量前均進行儀器質量控制,每月做1次腰椎模型,符合質控要求后進行檢查。

2 結果

2.1 研究對象的基本情況

研究對象各項生化指標、骨密度數據見表1。根據骨密度的差別將研究對象分為三組。

2.1.1骨質疏松組：骨科入院病人33例，平均67.7±13.4歲。男性4例，平均65.5±4.0歲；女性29例，平均68.0±12.2歲。

2.1.2骨量低下組：骨科入院病人74例，平均59.8±12.8歲。男性33例，平均59.5±15.4歲；女性41例，平均60.0±10.4歲。

2.1.3骨量正常組：骨科入院病人115例，平均54.1±10.0歲。男性73例，平均54.6±10.8歲；女性42例，平均53.4±8.6歲。

表1 石河子地區中老年人Q89R基因型之間生化指標、骨密度的比較Table 1 Comparison of biochemical indexes and BMD among Q89R genotypes in middle-aged and older people in Shihezi area

注：1.NA代表信息缺失；2.QR組數據的右上標表示，中老年女性QQ型與QR型各項指標比較，差異有統計學意義。a、b、c、d、e對應的P值依次為：0.041、0.009、0.003、0.048、0.049

Note: 1.NA represents“not applicable”；2.The right superscript in QR group data represents statistical significance where the difference was indicated between QQ genotype and QR genotype as in the middle aged and old female population. The correspondingPvalues of a, b, c, d and e respectively were 0.041, 0.009, 0.003, 0.048, 0.049 in order

2.2 LRP5基因Q89R位點多態性分布

本研究中，各組基因型及等位基因頻率符合遺傳學Hardy-Weinberg 定律(P>0.05)，顯示研究樣本為遺傳平衡群體。

2.3 基因型判定

從血液中提取人類基因組DNA(圖1)后，再進行PCR(圖2)，然后酶切得出結果。LRP5基因Q89R位點酶切后分為三型：QQ型(436bp)為野生型,QR型(436bp、274bp、162bp)為雜合子，RR型(274bp、162bp)為突變型。基因型可分別由酶切結果(圖3)、測序結果(圖4)判定。

2.4 基因型頻率分布

石河子地區中老年人群LRP5基因Q89R位點基因型頻率分布依次為QQ型(80.63%)、QR型(18.92%)、RR型(0.45%)，中老年女性LRP5基因Q89R位點基因型頻率分布依次為QQ型(82.14%)、QR型(16.96%)、RR型(0.89%)，中老年男性LRP5基因Q89R位點基因型頻率分布依次為QQ型(79.09%)、QR型(20.91%)、RR型(0.00%)。

圖1 用試劑盒從血液中提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為marker,1、2、3、4、5為人類基因組DNAFig.1 The agarose gel electrophoresis of DNA extracted from the blood using TIANamp Blood DNA Kit, M stands for Marker, 1, 2, 3, 4, 5 stands for the human genome DNA

圖2 經PCR產生的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為marker,1、2、3、4為目的DNA片段，分子量大小為436bpFig.2 The agarose gel electrophoresis of objective DNA fragment generated by PCR, M for marker, 1, 2, 3, 4 for the target of DNA fragments, the molecular weight is 436bp

圖3 經Ava Ⅱ酶切后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為Marker,1為QQ型，2為RR型，3為QR型Fig.3 The agarose gel electrophoresis of DNA fragments digested by enzyme Ava II, M stands for Marker, 1 for QQ genotype, 2 for RR genotype, 3 for QR genotype

2.5 不同人群基因型頻率分布

由表1可見,石河子地區中老年人群LRP5基因Q89R位點的等位基因頻率與高加索人群[5]有較大差異,高加索人群中的Q型等位基因頻率為100%，未發現R型等位基因。哈爾濱[6-7]、安徽[8]、上海[9]、韓國[10]的研究在數值上與本研究較為接近,但也有一定差別。

表2 不同人群LRPP5基因Q89R位點各基因型、等位基因的頻率分布Table 2 The distribution frequency of LRPP5 gene Q89R site polymorphisms in different populations

2.6 基因型與生化指標的相關性

中老年女性生化指標中，只有血清磷含量與基因型顯著相關(P<0.05)，QR型的血清磷濃度明顯低于QQ型；未見堿性磷酸酶、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、載脂蛋白-A與基因型相關(P>0.05)。中老年男性的各項生化指標均與基因型無關(P>0.05)。

2.7 基因型與骨密度的相關性

骨密度的衡量標準為T值：-1

在中老年女性群體中，L1、L2、L3的骨密度值與Q89R基因型相關(P<0.05)，L4的骨密度值與Q89R基因型無相關性(P>0.05)，并且大轉子的骨密度值與Q89R基因型相關(P<0.05)，未發現Ward’s三角區、股骨頸、股骨干的骨密度值與Q89R基因型具有相關性(P>0.05)。QR型的腰椎L1-L3、大轉子的骨密度明顯低于QQ型。中老年男性LRP5基因Q89R位點各型之間各個部位的骨密度均無統計學差異(P>0.05)。盡管中老年男性的LRP5基因Q89R位點的基因型與骨質疏松并無相關性(表3)，但中老年女性的LRP5基因Q89R位點的基因型與骨質疏松呈顯著相關(圖6)。

圖5 A、B、C分別為骨量正常者、骨量低下者、骨質疏松者的脊柱正位圖；D、E、F分別為骨量正常者、骨量低下者、骨質疏松者的骨密度測量數據圖Fig.5 A, B and C respectively stand for the AP spine images of normal bone density, osteopenia and osteoporosis； D, E, F respectively stands for the data of bone mineral density in the normal bone density, osteopenia and osteoporosis groups

3 討論

Johnston[11]指出，人群骨密度的差別20%取決于環境因素，80%取決于遺傳因素。LRP5作為Wnt共受體參與Wnt信號傳導，Wnt-β-粘連素途徑是Wnt蛋白觸發的一種主要信號轉導途徑，也被稱為規范化Wnt信號途徑。Wnt與LRP5、Fz蛋白形成復合物。激活下游信號并引起β-25粘連素穩定性增強，促使其轉運至核內與Lef1/Tcf轉錄因子結合，繼而影響基因的表達[12-13]，進而調節細胞生存、增殖、分化、遷移等細胞活動。多種基因與骨密度相關，不同的基因對骨礦鹽代謝的影響可能存在協同或拮抗作用。同一基因對不同地區、不同民族的BMD影響不盡相同。目前認為可能存在以下二種遺傳機制影響骨量：①分子結構層面的作用 即某一基因位點發生突變可能導致相應功能蛋白的分子結構改變，如膠原蛋白基因突變會引起膠原蛋白分子結構上的變化[14]；②通過影響骨代謝平衡 骨代謝是由破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成共同協調形成的骨重建過程，骨形成速率小于骨吸收速率從而引起骨量的丟失[15]。基因層面可通過調節骨重建過程而發揮對骨量的影響作用，如維生素D受體(VDR)基因[16]、雌激素受體(ER)基因[17]等都經過此途徑調節骨的代謝過程。

圖6 中老年女性QQ型中骨質疏松的比例明顯低于QR型(χ2=9.196,P=0.01)Fig.6 The proportion with osteoporosis in the QQ genotype was significantly lower than that in the QR genotype in middle-aged and older women(χ2=9.196, P=0.01)

QQQRc2POsteoporosis(♀)18106 9320 008? Lowbonemass(♀)374 Osteoporosis(♀)18105 6570 017? Normalbonemass(♀)375 Lowbonemass(♀)3740 0990 753 Normalbonemass(♀)375 Osteoporosis(♂)401 8970 168 Lowbonemass(♂)2211 Osteoporosis(♂)400 7790 377 Normalbonemass(♂)6112 Lowbonemass(♂)22113 8180 051 Normalbonemass(♂)6112

注：*表示組間比較差異有顯著性，P<0.05

Note:*indicating significant difference between groups,P<0.05

常規體檢人群中，骨量正常的患者占據較大比例，因此本研究將入院病人作為研究對象，骨量正常患者的比例較常規體檢人群小，利于骨量正常、骨量異常組間病人數量的均衡，更符合統計學要求。收集資料數據時，發現部分病人的載脂蛋白A數據異常，因此也將其納入生化指標中進行分析。經過統計學分析，不同基因型之間的載脂蛋白A的濃度并未呈現差異。本研究僅檢測出一例RR型病人，由于樣本量過少，無法進行統計學分析，因此不確定RR型是否能作為漢族人群預測骨質疏松的基因型。以往同類研究往往將腰椎第一節、腰椎第二節、腰椎第三節、腰椎第四節合為同一變量(L1-L4)來分析,本研究則將四節腰椎分別與Q89R基因型的關聯性分別進行分析，有助于研究的深化與細化。本研究顯示，中老年男性與女性人群在LRP5基因Q89R位點基因型與骨密度、生化指標相關性方面有較大差異，這可能與LRP5基因調節激素有關。在中老年男性群體骨量低下、骨量正常分組中，QR型中骨量低下占47.83%，QQ型中骨量低下占26.51%，雖然差異沒有統計學意義，但QR型骨量低下的比例明顯高于QQ型。統計學結果可以作為重要參考，但也要考慮臨床客觀實際情況，不必迷信P值，因此兩種基因型之間的差異仍然需要重視。以后的研究將擴大樣本量，以期得到更精確的數據。本研究對骨質疏松就要采用骨密度作為評價指標，這一點存在一定的局限性。本研究進行的基因與骨密度的關聯性分析，得出的是一種相關聯的現象,而未必是基因與骨密度的直接決定關系,故也存在一定的局限性。

Koh等[10]對219名韓國青年男性的研究發現，LRP5基因Q89R位點多態性與Ward’s三角區及股骨頸的骨密度存在相關性。Zhang等[9]則在對647名上海絕經后婦女研究發現Q89R的QQ基因型較QR/RR型股骨頸處密度更高。Van等[5]的研究未發現高加索人中LRP5基因Q89R位點的基因多態性，提示此位點的基因多態性分布可能存在種族差異。朱翔等[8]對安徽地區247名絕經后女性的研究發現，Q89R多態性與股骨頸和大轉子區骨密度顯著相關，與腰椎以及 Ward’s三角區骨密度無關。本研究顯示，在中老年女性群體中，L1、L2、L3、大轉子的骨密度值與Q89R基因型相關(P<0.05)，L4的骨密度值與Q89R基因型無相關性(P>0.05)。雖然都得出基因與骨密度相關的結論，但本研究只與朱翔的Q89R多態性與大轉子區骨密度顯著相關的結論相同，與其它研究的相關性所在部位并不相同。

本研究提示，LRP5基因Q89R多態性位點可能通過對骨密度、血清磷等相關因素的調控，進而影響中老年女性骨質疏松癥的發生、發展。對LRP5基因Q89R位點多態性的研究，使我們從基因水平上認識不同種族間骨質疏松發病率的差異, 這對骨質疏松病因學和防治具有重要意義。今后相關基因研究可以在基因篩查實驗的基礎上，充分考慮基因之間的連鎖不平衡以及基因之間的相互作用，以后還需要進一步擴大樣本含量以提高樣本代表性，使數據準確性達到更高的水平。并通過分子生物學、生物化學等各項手段來了解相關基因對骨質疏松的具體作用機制，進而探索出不同地區不同民族之間骨質疏松發病的危險因素以及積極因素，有助于為臨床治療提供更為合理治療方案，提高骨質疏松癥的預防、治療效果，對降低骨質疏松癥的發病率具有重要意義。