建立雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型的方法學(xué)研究

孫巖 陳冉 王小琦 張洋 蔣罡 胡敏 趙宏斌* 李文輝

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032 2. 昆明學(xué)院，云南 昆明 650032 3. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650032

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosisi，OP)是以單位骨量減少和骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，并導(dǎo)致骨脆性增加、發(fā)生骨折及相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加的一種全身性骨骼疾病[1]。由于人口老齡化加速，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率預(yù)計(jì)將增加，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。現(xiàn)在骨質(zhì)疏松研究對(duì)象多選擇雌性動(dòng)物，模擬絕經(jīng)后婦女由于雌激素分泌的減少導(dǎo)致的骨量丟失[3]，但是忽視了男性骨質(zhì)疏松的研究。隨著年齡的增加，男性性腺功能減退，雄激素分泌減少，會(huì)導(dǎo)致男性骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生[4]。目前全球有15%的60歲以上男性患有骨質(zhì)疏松癥[5]。在臺(tái)灣，骨質(zhì)疏松后骨折男性發(fā)病率42.3%大于女性發(fā)病率38.8%[6]。在我國(guó)，流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)60歲以上男性吸煙、飲酒、受教育程度低是骨質(zhì)疏松獨(dú)立因素[7-8]。被忽視的男性骨質(zhì)疏松問(wèn)題及后續(xù)發(fā)生的嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松后骨折帶來(lái)了更高的死亡率、社會(huì)成本，男性骨質(zhì)疏松癥的研究迫在眉睫。

目前骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建造使用雌性動(dòng)物去卵巢手術(shù)造模或者藥物造模；雄性動(dòng)物的骨質(zhì)疏松模型建造方法相關(guān)內(nèi)容很少。本研究參考雌性動(dòng)物造模方法，擬使用10月齡雄性SD大鼠，采取雙側(cè)睪丸切除手術(shù)造模和皮下注射D-半乳糖造模兩種方法建立雄性骨質(zhì)疏松模型，探尋雄性骨質(zhì)疏松模型的可靠建造方法，為進(jìn)一步研究男性骨質(zhì)疏松提供動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只3月齡雄性SD大鼠，購(gòu)買自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(大鼠生產(chǎn)許可證號(hào)：sc川-2013-24)，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所(溫度22±4℃,濕度65%±5%,晝夜周期12 h)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

飼養(yǎng)期間無(wú)大鼠死亡。飼養(yǎng)28周后，隨機(jī)平均分為4組(每組10只)：A組空白對(duì)照組，不做處理；B組手術(shù)組，行經(jīng)陰部雙側(cè)睪丸切除術(shù)；C組給藥組，每日頸部皮下注射100 mg/kg的D-半乳糖水溶液(1 g∶100 mL生理鹽水)；D組共處理組，同時(shí)行手術(shù)和藥物皮下注射。

手術(shù)組和共處理組動(dòng)物行經(jīng)陰部雙側(cè)睪丸切除術(shù)，術(shù)前12 h禁食禁水，使用10%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，深度麻醉后固定、脫毛、消毒，嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。于陰囊小切口暴露睪丸，結(jié)扎后切除，止血，逐層縫合。經(jīng)病理檢查證實(shí)睪丸切除完全。術(shù)后當(dāng)日到術(shù)后5天予青霉素1萬(wàn)單位/只，采用無(wú)菌醫(yī)用棉墊作為飼養(yǎng)墊料。術(shù)后7天傷口愈合，不拆線。手術(shù)組術(shù)后大鼠死亡1只，第8周骨密度測(cè)量后死亡大鼠2只，尸檢未見(jiàn)明確死因。

1.3 DXA雙能射線骨密度度測(cè)定

于術(shù)前、術(shù)后第8周使用7%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔麻醉后，俯臥位于檢測(cè)臺(tái)上，脊柱拉直，行雙能射線DXA骨密度測(cè)定(GE-Lunar 公司DXA 骨密度儀Prodigy 型及附帶的小動(dòng)物骨密度測(cè)定軟件測(cè)量)。

1.4 數(shù)據(jù)收集與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0分析，相關(guān)數(shù)值表示使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位。組間比較選擇單因素(ANOVA)方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 體重第8周，空白對(duì)照組、手術(shù)組、共處理、給藥組體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。空白對(duì)照組體重較第1周體重高，同時(shí)其余三組實(shí)驗(yàn)組體重較第1周體重降低，共處理組大鼠體重絕對(duì)值最低。見(jiàn)圖1。

圖1 SD大鼠體重Fig.1 Body weight of SD rats

2.2 骨密度及骨礦鹽含量

第8周，手術(shù)組、共處理組與對(duì)照組骨密度存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，均低于對(duì)照組全身骨密度；給藥組與對(duì)照組骨密度無(wú)差異(P>0.05)，但給藥組骨密度絕對(duì)值低于對(duì)照組骨密度。共處理組骨密度低于手術(shù)組骨密度，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。四組間骨礦鹽含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 第8周各組全身骨密度、骨礦鹽含量Table 1 BMD and BMC of each group at 8 weeks

注：與對(duì)照組比較，△△P<0.01，即兩組存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；△P<0.05，即兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；未標(biāo)注表示不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

2.3 組織、脂肪、肌肉含量

對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的組織含量、肌肉含量絕對(duì)值不同，但是互不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。對(duì)照組脂肪含量高于手術(shù)組、共處理組、給藥組脂肪含量，且存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；三組實(shí)驗(yàn)組之間脂肪含量不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組組織、脂肪、肌肉含量Fig.2 Tissue, fat and muscle content of each group

3 討論

在骨質(zhì)疏松的研究中，動(dòng)物模型被廣泛運(yùn)用，理想的動(dòng)物模型是研究者開(kāi)展骨質(zhì)疏松疾病相關(guān)研究的基礎(chǔ)。成年大鼠具有充足的皮質(zhì)骨重建，運(yùn)用于骨骼研究，其在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可保持穩(wěn)定，從而表現(xiàn)骨形成與吸收的動(dòng)態(tài)平衡。以往多選用雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型，手術(shù)去勢(shì)或藥物誘導(dǎo)后，骨量減少且骨密度降低明顯。

本實(shí)驗(yàn)著眼于雄性骨質(zhì)疏松相關(guān)研究較少，通過(guò)建立雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型對(duì)了解雄性骨質(zhì)疏松具有重要的意義。參考雌性骨質(zhì)疏松模型的手術(shù)建模與藥物建模方法，選用雙側(cè)睪丸切除法及D-半乳糖皮下注射法建立雄性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型并加以比較，研究有效的雄性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立方法；并聯(lián)合兩種方法對(duì)雄性大鼠進(jìn)行處理，觀察去勢(shì)和給藥對(duì)于雄性動(dòng)物骨質(zhì)疏松是否存在協(xié)同作用。

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第8周各組骨密度均高于第1周。已有研究表明，大鼠10個(gè)月～12個(gè)月才能達(dá)到骨密度峰值[9]，骨密度峰值過(guò)后進(jìn)入衰老期。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)10月齡大鼠骨密度峰值仍未達(dá)到，骨密度仍處在增長(zhǎng)期；一般來(lái)說(shuō)骨密度達(dá)到平臺(tái)期后建模為最理想時(shí)間，作為老年動(dòng)物模型，下一步考慮使用年齡更大的SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)第8周手術(shù)組骨密度低于對(duì)照組骨密度，且存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。已有報(bào)道稱手術(shù)切除雙側(cè)睪丸8周后大鼠骨密度(BMD)會(huì)顯著降低[10]，大鼠去勢(shì)8周后可以達(dá)到骨質(zhì)疏松。手術(shù)組雙側(cè)睪丸切除術(shù)是通過(guò)模擬老年男性性腺功能減退導(dǎo)致睪酮水平下降，骨密度流失所致的骨質(zhì)疏松[11-12]。給藥組骨密度雖然低于對(duì)照組骨密度，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。給藥組D-半乳糖通過(guò)皮下大劑量注射，會(huì)在大鼠體內(nèi)會(huì)經(jīng)氧化酶分解為CO2和木酮糖，伴有氧自由基和H2O2的產(chǎn)生，產(chǎn)生氧化損傷，形成亞急性衰老模型[13]；同時(shí)D-半乳糖的過(guò)量堆積影響骨的代謝，改變骨結(jié)構(gòu)的力學(xué)和生物力學(xué)參數(shù)，造成骨質(zhì)疏松[13-14]。本研究中給藥組骨密度下降不明顯，說(shuō)明連續(xù)8周使用D-半乳糖無(wú)法造成骨質(zhì)疏松，仍需延長(zhǎng)給藥時(shí)間。

另外，共處理組骨密度與手術(shù)組骨密度均低于對(duì)照組，共處理組骨密度較手術(shù)組骨密度降低5.6%，兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏睪酮的機(jī)體內(nèi)，D-半乳糖造成的骨量丟失更加明顯；而在單獨(dú)使用D-半乳糖的給藥組中，骨量丟失不明顯。睪酮是否存在一種抗氧化應(yīng)激作用，避免D-半乳糖在骨代謝中的堆積。這將是我們下一步研究的方向。

值得關(guān)注的是，第8周三組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比脂肪含量顯著下降(P<0.01)。很多研究表明雌性骨質(zhì)疏松模型建立后，雌性動(dòng)物脂肪含量均會(huì)代償性增加。而在雄性動(dòng)物模型中，其脂肪含量卻在建立骨質(zhì)疏松模型后較少。其機(jī)理可能與睪酮抑制瘦素的表達(dá)有關(guān)。切除睪丸后，機(jī)體瘦素分泌增加，脂肪含量減少。同時(shí)，D-半乳糖導(dǎo)致機(jī)體衰老，內(nèi)環(huán)境代謝紊亂也會(huì)導(dǎo)致脂肪含量減少。這樣，睪酮減少和機(jī)體衰老對(duì)機(jī)體脂肪含量的影響，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于骨骼肌-機(jī)械負(fù)荷對(duì)于骨質(zhì)疏松的代償性保護(hù)，結(jié)果就表現(xiàn)為雄性動(dòng)物骨質(zhì)疏松后脂肪減少。

本研究討論并說(shuō)明了去勢(shì)法第8周雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立；去勢(shì)法和D-半乳糖給藥法聯(lián)合使用第8周建立骨質(zhì)疏松模型，骨密度下降更為顯著；雄性大鼠骨質(zhì)疏松后，脂肪含量減少，與雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型后脂肪增加不同。