雙膦酸鹽及其聯合甲氨蝶呤對CIA大鼠炎癥與骨破壞影響的研究

解駿 肖漣波 黃新星

上海市光華中西醫結合醫院，上海 200052

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性全身系統性自身免疫性疾病，全球患病率約1%～3%。RA能引起關節的疼痛、僵直及腫脹，在發病2年內即可能出現全身性骨質疏松和近關節的骨破壞，進而發生不可逆的關節損傷，致殘率達50%。在我國約有四五百萬人深受RA 的困擾[1-2]。RA的特征表現為對稱性、慢性、進行性多關節炎并伴有全身多系統受累。關節滑膜的病理改變為慢性炎癥、增生形成血管翳，侵犯關節軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關節軟骨、骨和關節囊破壞，最終導致關節畸形和功能喪失，并伴有局部和全身骨質的丟失。RA在疾病發展和治療過程中會并發骨質疏松是RA的常見并發癥之一，因此，在美國風濕病協會(American College of Rheumatology，ACR)提出的RA治療指南增補文件中，就強調了對骨質疏松的防治，學術界也圍繞著RA并發骨質疏松及骨破壞進行了諸多方面的研究。雙膦酸鹽(bisphosphonate，BP)類藥物是近20年來發展起來的一類新藥，1997年以來第二代雙膦酸鹽類藥物(主要為阿侖膦酸鈉等)上市，并逐漸被廣泛應用，對老年性骨質疏松癥和絕經后骨質疏松癥有顯著治療效果。但對于RA的臨床效果，未見明確的文獻報道。因此研究雙膦酸鹽對RA患者的骨破壞的防治作用，對于臨床工作有指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：Wistar 大鼠，40只，雌性，7～8周齡，體重160～180 g，2只/籠，分籠飼養，購買自中國科學院上海實驗動物中心，飼養環境為上海交通大學醫學院實驗動物科學部SPF級動物房，大鼠自由飲水及進食，室溫(25±1)℃，動物適應性飼養5d后進行實驗。

1.1.2主要試劑和藥物：牛II型膠原蛋白，購自Chondrex公司；完全弗式佐劑(CFA)，美國sigma公司；不完全弗式佐劑(IFA)，美國sigma公司；冰醋酸，北京化學試劑公司；自擬補腎強骨方(方劑為骨碎補、白芍、仙靈脾、豨薟草、補骨脂、青風藤、黃芪、絡石藤)。此中藥復方是我院已多年臨床使用，并經實驗驗證確有控制RA炎癥的作用。雙膦酸鹽(福善美)，規格：70mg×1片/盒，國藥準字J20080073，購自杭州默沙東制藥有限公司；恩利注射粉劑，規格25 mg/瓶，批準文號S20100019，購自德國惠氏；MTX注射5 mg/支，批準文號H20080251，Ebewe Pharma Ges.m.b.H.Nfg.KG。

1.1.3模型建立及評定方法：(1)牛II型膠原的乳化。①配制乙酸溶液：溶解無水冰醋酸于滅菌用水，配制0.05 mol/L的乙酸。②配制膠原溶液：向牛II型膠原中加0.05 mol/L的乙酸溶液，使膠原溶液終濃度為4 mg/mL，放入4℃冰箱中避光攪拌過夜。③配制膠原乳劑：將4 mg/mL膠原溶液與CFA等體積乳化(注射器法，冰上操作)，使膠原終濃度為2 mg/mL，用于初次免疫；將4 mg/mL膠原溶液與IFA等體積乳化，使膠原終濃度為2 mg/mL，用于激發免疫。(2)大鼠免疫方法。①初次免疫：用2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠(0.3mL/只)，于每只大鼠尾根部皮下注射0.12 mL膠原乳劑(含膠原240 μg)。②激發免疫：初次免疫后第7天于大鼠臀背部兩側各皮下注射0.03 mL膠原乳劑(共含膠原120 μg)。(3)模型評價方法。①觀察關節形態：發病大鼠腫脹關節主要出現于雙下肢踝關節和足趾各關節，可通過觀察大鼠關節形態的變化判斷發病情況。②關節炎癥評分：大鼠關節炎癥程度評價采用評分法(0～4分)，分級評分及表現見表1。

表1 大鼠四肢關節炎癥評分及表現Table 1 The joint inflammation score of rats

1.2 分組與給藥方法

1.2.1入組標準：炎癥評分≥2分即隨機入組[3]。

1.2.2分組情況：空白組：滅菌用水治療組8只。對照組：恩利+MTX治療組8只。治療組： BP+自擬補腎強骨方治療組8只；BP+MTX組治療組8只；BP治療組8只。

1.2.3給藥方法及劑量：滅菌用水3 mL/只/天，灌胃。雙膦酸鹽1.5 mL/只Qw (6.34 mg/Kg，1.3 mg/只)，灌胃。

1.2.4自擬補腎強骨方組：按照美國FDA提出的臨床等效劑量換算公式。該方水煎2次，煎液過濾，混合后加熱濃縮，劑量含生藥量1.3 g/mL，4℃保存備用，每只大鼠每天3 mL，分兩次灌胃。MTX 0.2mL/只(1 mg/只) Qw 腹腔注射；恩利0.2 mL/只Biw(0.8 mg/只)，腹腔注射。

1.3 關節炎癥判定方法

從治療的第1天開始，隔天按表1所示記錄關節炎分數，每只大鼠的關節炎分數為雙下肢評分的總和，共記錄28天。

1.4 關節破壞程度檢查方法

1.4.1脛骨上段松質骨組織形態計量學檢查方法：硬組織切片制備完成，甲苯胺藍染色后，置于帶有專門骨組織形態計量學測量系統軟件的半自動圖像分析儀上，200倍光鏡下，于脛骨上段骨骺線下1～4 mm間次級松質骨區域內每個標本隨機選取5個視野，保存待分析。

在半自動圖像分析儀上，測量每個視野的總面積即骨組織面積(Tissue area，T.Ar)，測量每個視野下骨小梁總周長(Trabecular perimeter，Tb.Pm)、骨小梁面積(Trabecular area，Tb.Ar)。將測得的上述參數帶入表2計算：骨小梁面積(Tb.Ar)、骨小梁寬度(Tb.Wi)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

表2 松質骨組織形態計量學靜態計算參數Table 2 Histomorphometry parameters of trabecular bone

1.4.2大鼠左側股骨及第5腰椎骨生物力學的檢查方法：治療4周后，處死大鼠取左側股骨全長及第5腰椎去除軟組織，2 h內行骨生物力學檢查，比較各組治療后股骨及第5腰椎的生物力學的變化。處死大鼠取左側股骨全長及第5腰椎去除軟組織，修整椎體上下關節面，使上下關節面保持平行。取完標本后予以0.9%生理鹽水紗布包裹標本，2 h內行骨生物力學檢查，比較各組治療后股骨及第5腰椎的生物力學的變化。測試室溫控制于37℃，股骨干參數的取股骨干的中點的前后徑及左右徑平均值為直徑，跨距為2 cm，加載速率為2 mm/min。股骨測試時均為同一方向，股骨頭朝上，股骨小結節遠端和股骨髁上分別為二點置于測試儀上，股骨干的中點為受力點。腰椎參數分別取：椎體前后徑和左右徑的平均值；椎體的高度；加載速率為2 mm/min。股骨三點彎曲實驗以股骨斷裂為實驗終點，腰椎壓縮實驗以椎體被壓縮1/3為實驗終點。

1.5 統計學處理

采用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，數據符合正態分布，按照均數±標準差表示，若各治療組方差齊，采用單因素的方差分析及LSD-t檢驗進行組間的兩兩比較；單獨兩組樣本均數比較時，若方差齊，采用t-text，若方差不齊，改用t′檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 炎癥評分

將隔日記錄的關節炎癥分值結果繪制成關節炎癥分值曲線(見圖1)，從圖中可以看出在治療前7 d，所有的各治療組都經歷了一個炎癥上升的階段，在第2周左右各治療組對膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠關節炎癥分值出現較大的變化。恩利+MTX組的炎癥評分快速下降，BP+自擬補腎強骨方及BP+MTX組的炎癥評分則緩慢下降，而BP組的炎癥則無明顯降低，對照組的炎癥評分仍然較高。

圖1 治療過程中各組大鼠關節炎癥分值變化曲線Fig.1 The curve of rats’ joint inflammation score change in each group during treatment

對治療第1天實驗數據進行統計分析，在治療第1天，4個治療組炎癥平均分值均在4.5分左右，任何兩組之間比較差異均沒有統計學意義，說明在治療之初4個治療組平均炎癥分值相當。見圖2。

圖2 治療第1天各治療組大鼠關節炎癥分值比較Fig.2 On the first day of treatment, the comparison of rats’ joint inflammation score in each group

對治療第28天實驗數據進行統計分析，治療28 d后，與滅菌水治療比較，BP+自擬補腎強骨方及BP+MTX組(P<0.05)、恩利+MTX組(P<0.01)炎癥平均分值顯著降低，但BP組無顯著變化。BP+自擬補腎強骨方、BP+MTX組及恩利+MTX組的炎癥平均分值差異無統計學意義，但恩利+MTX組高于BP組炎癥平均分值(P<0.05)。這說明BP+自擬補腎強骨方及BP+MTX組均對CIA大鼠炎癥具有明顯抑制作用，兩組對CIA大鼠炎癥的抑制作用相當。見圖3。

圖4 大鼠脛骨上段矢狀面比較(治療4 w，Micro-CT掃描)Fig.4 The comparison of sagittal plane at rats’ proximal tibia (after 4 weeks treatment, scanned by Micro-CT)

圖3 治療第28天各治療組大鼠關節炎癥分值比較(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001)Fig.3 On the 28th day of treatment, the comparison of rats’ joint inflammation score in each group (*to express P<0.05,** to express P<0.01,*** to express P<0.001)

2.2 骨組織形態計量學參數分析

2.2.1脛骨上段矢狀面松質骨變化比較：藥物治療4 w后，取各治療組大鼠脛骨上段行Micro-CT掃描，得到脛骨上段矢狀面如圖4所示，治療4 w后，滅菌用水組大鼠脛骨平臺前方出現塌陷，骨骺線向前傾斜，骨骺線下1～4 mm間的次級松質骨骨小梁稀少凌亂，相反BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組及恩利+MTX組大鼠脛骨平臺均保持正常結構形態，骨骺線呈蝶形、清晰可見，骨骺線下1～4 mm間的次級松質骨骨小梁數量明顯多于滅菌用水組，骨小梁沿豎直應力方向排列較整齊。但相比較而言，BP組的骨小梁數量相對其他3個治療組要稀疏，排列也不如其他3個治療組整齊；而BP+自擬補腎強骨方及BP+MTX組則未見明顯差異。

圖5 各治療組骨小梁面積百分數比較(治療4 w，大鼠不脫鈣骨組織5 μm切片，甲苯胺藍染色，200×，**表示P<0.01，*表示P<0.05)Fig.5 Picture is the percentage of trabecular area of each treatment group compared( after 4 weeks treatment, rats’ hard tissue slices, 5um thick, toluidine blue stain,200×,**to express P<0.01，* to express P<0.05)

圖6 骨組織形態計量學數據比較(治療4 w后，大鼠不脫鈣骨組織5 μm切片，甲苯胺藍染色，200×)。數據經過統計學分析，圖A、B、C分別代表了骨小梁寬度、骨小梁數量及骨小梁分離度之間的差異(**表示P<0.01，*表示P<0.05)Fig.6 The comparison of bone histomorphometry data (after 4 weeks treatment, rats’ hard tissue slices, 5 um thick, toluidine blue stain,200×). After statistical analysis, picture A、B、C express data different significantly among trabecular width, trabecular number and trabecular separation(**to express P<0.01，* to express P<0.05)

2.2.2脛骨近端骨組織切片參數比較：治療4 w后，各治療組骨組織切片制作完成后，甲苯胺藍染色，置于帶有專門骨組織形態計量學測量系統軟件的半自動圖像分析儀上，200倍光鏡下，于脛骨上段骨骺線下1～4 mm間次級松質骨區域選取各組視野，計算出骨小梁面積百分數(見圖5)。骨小梁面積百分數是評價藥物對骨量影響的最重要的客觀指標，統計分析后發現，BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組及恩利+MTX組骨小梁面積百分數均高于滅菌用水組(P<0.05)，而3組之間差異無統計學意義。 這也反映了BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組、恩利+MTX組均具有明顯地抑制CIA大鼠炎癥關節周圍骨量丟失的能力，且3組治療藥物抑制骨量丟失的能力相當。

骨小梁面積百分數是評價藥物對骨量影響的最重要客觀指標，從數學公式上推算，它等于骨小梁寬度與數量乘積的1/10，即骨量多少由寬度和數量兩者共同決定，骨小梁寬度與數量的變化主要用于描述骨小梁形態結構，解釋骨量變化。從圖6A中可以看出治療4 w后BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組、恩利+MTX組骨小梁寬度與滅菌水組均高于滅菌水組(P<0.05)，而3組之間差異無統計學意義。而圖6B中顯示BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組骨小梁數量明顯高于滅菌水組(P<0.05)，而BP及恩利+MTX組骨小梁數量與滅菌水組差異無統計學意義。說明BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組均能夠明顯抑制CIA大鼠炎癥關節周圍骨小梁數量的減少及提高骨小梁寬度；同時，也說明BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組藥物抑制骨量減少的作用主要是通過抑制骨小梁數量減少及提高骨小梁寬度來實現的。

骨小梁分離度是指骨小梁之間的平均距離，也是用于描述骨小梁形態結構的重要指標。分離度越大，骨小梁之間的距離就越大，意味著骨質越疏松。從圖6C中可以看出，恩利+MTX組骨小梁的分離度低于滅菌水組(P<0.05)；BP+自擬補腎強骨方組、BP+MTX組與滅菌水組之間骨小梁分離度差異無統計學意義。

2.3 骨生物力學參數比較

在治療4 w后，經統計分析后發現，在腰椎壓縮實驗中，與滅菌水組相比較，BP+補腎強骨方組(P<0.05)、BP+MTX組(P<0.05)及MTX+恩利組(P<0.05)差異均有統計學意義，而單獨使用BP組則差異無統計學意義(圖7A)。在圖7B股骨三點彎曲實驗中，與滅菌水組相比較，BP+自擬補腎強骨方組(P<0.05)、MTX+恩利組(P<0.001)差異均有統計學意義，BP組與MTX+恩利組比較差異有統計學意義(P<0.05)，余各組間比較差異無統計學意義。

圖7 大鼠股骨三點彎曲實驗及腰椎壓縮實驗比較(治療4 w，骨生物力學儀檢查)Fig.7 The comparison of three-point bending test of femur and lumbar vertebrae compression test (after 4 weeks treatment, scanned by Bone-biomechanical device)

綜上，BP聯合自擬補腎強骨方與BP聯合MTX對CIA大鼠關節炎癥均具有明顯抑制作用，且BP聯合自擬補腎強骨方與BP聯合MTX作用相當。但單獨使用BP對于CIA大鼠關節炎癥無明顯緩解作用。BP聯合自擬補腎強骨方、BP聯合MTX與恩利聯合MTX均具有明顯的抑制CIA大鼠炎癥關節周圍骨量丟失的能力，單獨使用BP則無明顯緩解作用。BP聯合MTX或自擬補腎強骨方均能明顯抑制CIA大鼠關節炎癥反應、關節侵蝕及關節周圍骨丟失的作用。

3 討論

雙膦酸鹽對骨骼和礦物質有很強的親和性，可抑制羥膦灰石結晶及其總體物質的形成、生長和溶解，且抑制結晶的形成比抑制其形成和生長的需要量低，故小劑量的雙膦酸鹽類藥物即可抑制骨吸收。臨床常用的雙膦酸鹽類藥物有依替膦酸二鈉、帕米膦酸鹽、阿侖膦酸鈉、利塞膦酸鈉、唑來膦酸等。口服雙膦酸鹽可增加骨密度，減少椎體骨折風險。

類風濕關節炎(RA)是一種以關節及關節周圍組織的非感染性炎癥為主要表現的自身免疫性疾病。我國大陸地區RA 患病率約為0.2%～0.4%[4]，預后多引起關節功能障礙，影響患者生活質量。RA的兩大病理表現為炎癥和骨破壞，臨床上一般應用緩解病情藥物、激素及生物制劑治療。含氮的雙膦酸鹽可以通過抑制破骨細胞的甲羥戊酸途徑，從而抑制下游的包括Rho、Ras、Rab在內的蛋白合成[5]，這一途徑與炎癥有關。Rho與炎癥相關，可以促進巨噬細胞和淋巴細胞向炎癥組織遷移，產生炎癥應答[6]。同時雙膦酸鹽還可以通過其對破骨細胞的抑制作用和對軟骨細胞的保護作用，減少和預防RA 產生的骨破壞[7]。

RA和骨破壞傳統上認為是免疫系統和骨代謝系統兩個系統的疾病，互不相干，近些年大量證據提示RANKL-RANK系統在RA骨破壞中的強大機制。RA動物模型得出一致的結論，炎癥關節中RANKL表達上調[8-12]，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)水平下降，RANKL與OPG比率與破骨細胞活性及局部骨侵蝕程度呈正相關；相反RANKL抑制劑可明顯減輕骨侵害，如RANKL基因敲除小鼠表現為可抵御與關節炎相關的關節侵蝕，并在關節中少見破骨細胞[13]；OPG能抑制骨侵蝕及破骨細胞，也能減少關節炎大鼠關節周圍的骨量丟失[14]。

因此炎癥與骨質疏松是兩個密切相關的問題，如果只是治療繼發骨質疏松，往往不能取得預期效果。本次研究也表明，單純使用BP治療RA繼發骨質疏松是沒有任何效果的，但如果聯合具有確切療效的緩解RA炎癥的方案，對于改善骨質疏松的效果則明顯顯現。國外研究表明，對于女性絕經后類風濕關節炎患者的研究發現股骨骨密度與圍繞近側大腿肌肉截面積、絕經時間有差異，而單純BP治療對股骨骨干的骨密度沒有顯著效果[15]。但也有研究表明，同樣對于絕經后類風濕關節炎女性患者，伴有使用皮質激素史，在維持原治療RA方案的不變，加用阿侖膦酸鈉或利塞膦酸鹽治療。12個月后腰椎和股骨頸骨密度和DAS28與原先基線相比，改善顯著。對于絕經后RA女性患者，聯合BP能提高骨密度與減緩疾病活動的作用[16]。另一個研究結果也表明，單獨使用BP對于防治RA繼發骨質疏松及繼發股骨頸骨折的效果并不理想，當BP聯合他汀類藥物則有明顯效果[17]。

RA 并發骨質疏松癥已經得到了流行病學研究的證實。炎癥活動是RA 骨質丟失相關的最重要因素，徹底控制炎癥的前提下聯合使用BP類藥物是治療繼發性骨質疏松的最佳方案。