甲狀旁腺素(1-34)對去卵巢大鼠摻鍶羥基磷灰石涂層種植體骨整合的影響

孫燾 陶周善 屠凱凱 黃正亮 周強 李杭 白炳力 楊雷*

1. 溫州醫科大學附屬第二醫院骨科，浙江 溫州 325000 2. 皖南醫學院第一附屬醫院(弋磯山醫院)創傷骨科，安徽 蕪湖 241000

人工關節置換術是治療某些關節嚴重創傷時較為常見且有效的骨科手術，如髖關節、膝關節等損傷。然而，內植入體穩定性不佳仍然是個嚴重的問題，并常常因包括無菌性松動在內的各種原因而迫使關節置換術后翻修[1]。運用生物活性材料涂層是鈦表面性質改性的一種常用方式。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層植入體在過去用于全髖關節形成術后臨床結果顯示，HA涂層假體對于非骨水泥假體在關節形成術中是一個有效的替代[2]。盡管HA-涂層加強了植入體周圍疏松骨中的骨形成，與在正常骨骼中的植入體相比，骨質疏松骨中植入體的假體并不穩固[3]。近年來，由于鍶(Sr)可以抑制破骨活動并增強成骨細胞活性提高骨形成，降低骨的重吸收[4]特性，已有研究顯示摻鍶羥磷灰石涂層對于內植物的骨整合有積極作用[5]。研究表明甲狀旁腺激素(1-34)(parathyroid hormone，PTH)的間斷使用通過增加成骨細胞的數量及活性，減弱成骨細胞的凋亡，從而提高其合成作用，可以明顯提高內植物的骨整合[6]。綜上所述，筆者假設PTH也可能有助于增加摻鍶內植物部位骨組織形成，增加內植物的骨整合。本研究的目的在于確認間斷給予PTH增加摻鍶羥基磷灰石涂層(Sr-HA)鈦棒在骨質疏松條件下的骨整合。

1 材料與方法

1.1 涂層種植體的制備

用商業純鈦定制40個直徑1.2 mm，長 20 mm的柱狀鈦棒 (江廣磁醫療器械有限公司)。經噴砂、酸蝕后在超聲清洗機內分別用70%乙醇、去離子水清洗材料，自然干燥。通過電化學沉積在其表面制備HA和摻鍶羥基磷灰石(Strontium-substituted hydroxyapatite，Sr-HA)涂層，具體方法參照文獻[5，7]。涂層通過XRD(x—Ray Di ffraction，X射線衍射)來定量定性的分析，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察樣品表面的特征來確保涂層和文獻的結果相似(具體方案省去)。本實驗中采用鍶元素置換羥基磷灰石中摩爾分數10%的鈣元素。

1.2 實驗動物

12 w齡SPF級SD雌性大鼠50只，體重225～250 g，由上海斯萊克動物公司提供，許可證號：(SCXK(滬)2007-0005，合格證號：2007-000548429)。所有動物在溫度為(24.0±0.5)℃，濕度為45%～50%，通風良好的環境下飼養，每周稱體重1次。

1.3 動物模型的建立及治療

50只大鼠隨機分成2組即OVX組(n=45)切除雙側卵巢以建立骨質疏松動物模型和Sham組不切除雙側卵巢建立假手術模型，具體手術步驟參考以前發表的文章[8]。簡單而言，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下1/3處作一長約 2 cm 縱行切口，向兩側鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結扎，完整摘除雙側卵巢，逐層縫合，關閉創口。正常環境下飼養12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測量儀檢測檢驗骨質疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機分成4組：Control組、Sr組、PTH組、PTH+Sr組。每只大鼠植入2枚相同的鈦棒，Control組及PTH組大鼠雙側股骨內各植入1枚HA涂層鈦棒，Sr組及PTH+Sr組大鼠雙側股骨內植入表面含10%鍶元素的Sr-HA涂層的種植體，具體手術步驟參考以前發表的文章[9]。鈦棒植入術后第一天開始PTH組、PTH+Sr組大鼠術后給予PTH(Forsteo；Eli Lilly，Houten，荷蘭)60 μg/kg皮下注射，每周3次直至去卵巢術后12 w。隨后處死所有大鼠，取股骨行Micro-CT、骨生物力學、硬組織組織切片檢測。

1.4 Micro-CT 評價

術后12 w，用Micro-CT(SkyScan1176，荷蘭)觀察種植體周圍骨形成情況。每組剩余的10 個標本連同周圍骨組織取出后，掃描垂直于股骨的長軸，用 Micro-CT 連續掃描。在所成圖像中圍繞種植體周圍250 μm 厚的區域設為興趣區，從股骨干骺端板約 2 mm 開始連續 80個斷層，以 205 的閾值來提取圖像信息。掃描后利用 Micro-CT 配套的軟件系統直接計算骨體積分數(bone volume ratio，BV/TV)=所選區域骨組織體積/所選區域總體積，骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，即所選區域骨小梁的平均厚度，骨小梁數量(trabecular number， Tb．N)，表示所選區域骨小梁的數量多少， 骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)，即所選區域骨小梁間髓腔的平均寬度，連接密度(connectivity density，Conn.D)[7]。

1.5 生物力學測試

Micro-CT 掃描完后將樣本放在萬用材料測試系統上(Instron 5565，Instron，美國)， 以1mm/min的恒定速度沿種植體長軸將其從骨組織中推出， 并用視頻引伸計記錄整個過程。取加載的最大負荷值為最大推出強度，用最大推出強度除以種植體與骨接觸面面積為界面剪切強度[7]。

圖1 鈦棒植入術后12 w各組大鼠股骨內植物Micro-CT、硬組織切片及骨生物力學結果Fig.1 Results of micro-CT, hard tissue sections, and bone biomechanical properties in rats after implantation of titanium rod for 12 weeks注：Vs. Control，*P<0.05；Vs. Sr組，#P<0.05；Vs. PTH組，&P<0.05 (采用單因素方差分析及t檢驗)

1.6 硬組織切片標本的制備和組織學檢查

用于制作硬組織切片的標本被置于4%的中性甲醛緩沖溶液中3d。然后洗凈甲醛溶液，梯度濃度乙醇脫水后， 不脫鈣包埋于甲基丙烯酸甲酯中， 在骨骺板上約 2 mm處切片(SP1600， Leica，德國)，厚約40 μm，經 Van Gieson 染色后顯微鏡下采集圖片，將距種植體表面100 μm 的區域設為興趣區，并用Image Pro-plus 6.0分析。骨-種植體接觸率(bone-to-implant contact rate，BIC)=種植體與骨直接接觸部分的長度÷種植體表面的長度×100%，骨面積比率(bone area ratio，BAR)=所選區域骨面積/所選區域的總面積×100%[7]。

1.7 統計學處理

2 結果

所有大鼠都順利通過了手術并且恢復較快，在整個實驗過程都處于良好的健康狀態，鈦棒植入處未見感染、切口愈合不良等并發癥。術后12 w時兩組大鼠股骨的骨密度變化骨密度測量儀檢測所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為(238.34±31.56)mg/cm2，而OVX組大鼠的股骨骨密度為(174.24±29.43)mg/cm2。相對Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降36.78%(P<0.05)，結果表明骨質疏松模型建立是成功的。安樂死后，植入體周圍沒有臨床顯示炎癥癥狀及不良組織反應。這表明局部使用鍶聯合全身的使用PTH不會產生全身不良反應。

2.1 Micro-CT評估

三維重建圖像清晰的顯示了對照組組與治療組鈦棒表面及周圍骨組織骨小梁微結構的改變情況(圖1E)。Micro-CT定量分析結果如表1所示。PTH和Sr涂層的聯合使用在所有實驗組Micro-CT檢測指標中顯示出最佳效果。與Control組相比，PTH+Sr組BV/TV增加了2.45倍，Tb.N增加了2.94倍，Conn.D增加了2.31倍，Tb.Th增加了1.56倍，而Tb.Sp降低了1.65倍(P<0.05)。Sr組與PTH組和PTH+Sr組相比表現為更低微觀參數(P<0.05)。

表1 鈦棒植入股骨術后12 w時內植物感興趣區Micro-CT定量分析結果Table 1 Quantitative analysis of micro-CT in the region of interest in 12 weeks after implantation of titanium rod into the femur

Note:*Vs. Control,P<0.05,#Vs. Sr group,P<0.05, &Vs. PTH group,P<0.05(單因素方差分析和t檢驗)

2.2 組織學評估

硬組織切片結果展示在不同手段干預下鈦棒周邊骨質改變的情況(圖1F)。相較于OVX組，所有的治療在組織形態定量分析中都有BAR和BIC的顯著提高(P<0.05；圖1G、B、C)。12w時，Sr組、PTH組及PTH+Sr組的BAR相較于控制組分別提高了1.52倍、1.73倍及2.30倍(P<0.05)，它們的BIC接觸率分別提高了1.35倍、1.56倍及2.21倍(P<0.05)。

2.3 生物力學測試

Sr組、PTH組及PTH+Sr組的最大推力分別較HA組表現為1.27倍、1.36倍及1.61倍增長(P<0.05)。所有有股骨植入體的組中，PTH+Sr組所觀察到的強度效果最大(P<0.05) (圖1 G、A)。

3 討論

此研究評估了系統使用PTH及摻鍶涂層對OVX大鼠股骨干骺端植入鈦棒的影響。實驗結果表明PTH與摻鍶涂層在大鼠中的聯合使用中顯著提高了OVX大鼠鈦棒表面的骨形成及其穩定性。PTH+Sr組大鼠鈦棒表面更多新骨形成提示聯合使用PTH和摻鍶涂層對于骨質疏松患者人工關節置換術后假體穩定方面具有重要意義。

實驗再次證實了以前研究發現PTH可以促進去卵巢大鼠內植物的骨整合[10]。實驗結果顯示PTH組的BAR和BIC較HA組分別提高了1.77倍及1.53倍。類似的結果也在生物機械實驗中得到，PTH組的最大推力是Control組的1.31倍。最近的研究表明，PTH可以誘導動物成骨細胞形成，增加骨小梁的量和質，提高骨量和強度[11]。此外，PTH可以直接增加骨髓中骨祖細胞復制，通過刺激骨祖細胞向成骨細胞的增殖與分化增加成骨細胞數量，激活骨襯細胞來減緩成骨細胞的凋亡。

目前，有實驗比較研究Sr涂層對于內植物骨整合的影響，局部使用Sr涂層不會對骨組織及周圍軟組織有干擾作用，筆者的研究結果證實Sr涂層可以提高去卵巢大鼠內植物的骨整合[12]。多種實驗表明Sr可以通過阻礙破骨細胞活性減少骨吸收，刺激成骨細胞活性增加骨形成[13]。具體來說，Sr可以提高成骨細胞的復制和成骨細胞活性，包括骨基質合成和堿性磷酸酶的產生，減少骨髓細胞分化時產生的破骨細胞標記物，抑制破骨細胞分化，減弱破骨細胞活性，減少其他祖細胞的向破骨細胞分化。筆者的實驗結果顯示Sr涂層可以明顯提高鈦植入體表面骨組織重建和新骨形成。本實驗中使用PTH的劑量率(60 μg/kg，每周3次)類似于嚙齒動物模型實驗中常規使用的量[14-15]，但遠高于人體治療劑量(40～100 μg/d)[16-17]，因此，PTH在嚙齒類動物中使用的劑量通常是在人體使用治療劑量的20～100倍。然而，很少有報道顯示類似人類治療劑量PTH對動物骨密度和骨量有明顯的影響。相反，較高劑量的PTH一般認為對骨量或骨密度及血清鈣水平有顯著的影響[18-19]。

PTH與Sr涂層的聯合使用可以明顯增加去卵巢大鼠鈦棒表面的骨形成。具體機制尚不明確，主要歸因于局部骨形成的增加及Sr對于移植體穩定性的局部功能以及PTH的綜合功能。 PTH可以刺激胰島素生長因子，從而增加細胞增殖，減少凋亡[20]。結果顯示，PTH增加了骨小梁量及厚度，并最終增加骨密度與骨質。筆者的研究結果證實PTH提高了所有髓腔中骨組織的形成和再生，而不只是植入體的表面。同時，Sr-HA的溶解在植入體骨整合的提高中發揮了重要作用。具體來說，HA溶解可以帶來涂層中的鍶離子、鈣和磷，從而增加植入體表面的這些離子濃度。這些離子都可以增加成骨細胞功能和新骨形成。Sr-HA結晶度的降低進一步提高了溶解度，從而提高了局部鍶離子的釋放及新骨的形成[21]。因而，高溶解性的Sr-HA涂層刺激骨生長進入植入體的表面。

綜上所述，本研究證實在骨質疏松狀態下摻鍶羥基磷灰石涂層結合間斷給予PTH 能有效提高內植物周圍的骨形成及穩定性。盡管目前為止所有實驗局限于動物實驗，隨著本實驗組研究的進一步深入，將為臨床解決骨質疏松骨整合問題提供一條新的思路。