朝醫八物君子湯拮抗房顫及對Cx40、Cx43表達的影響

金 玉，張默函，洪 蘭，崔昊震

（1. 延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學中醫學院，吉林 延吉 133002）

朝醫八物君子湯拮抗房顫及對Cx40、Cx43表達的影響

金 玉1，張默函2，洪 蘭2，崔昊震3

（1. 延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學中醫學院，吉林 延吉 133002）

本文通過觀察朝醫八物君子湯拮抗房顫及對心房 肌縫隙連接蛋白Cx 40、Cx43蛋白表達的影響得出結論，朝醫八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘發房顫的作用，其機制主要與提高Cx40、Cx43蛋白表達水平有關。

朝醫八物君子湯；房顫；Cx40；Cx43

朝醫八物君子湯是來源于《東醫壽世保元》中的少陰人方劑，其主要組成由人參、黃芪[1]、白術、白芍、當歸、川芎、陳皮，甘草等8味藥物構成，具有補脾和脾，補氣和血之功效，臨床上常可用于治療少陰人驚悸、怔忡等疾病。本研究通過采用急性房顫模型，觀察和探討八物君子湯對房顫大鼠心房肌CX40和CX43蛋白表達、心房肌細胞微結構變化及對ANP分泌的影響，旨在闡明八物君子湯拮抗房顫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

實驗動物均采用雄性SD大鼠（體重為200±20 g）。由延邊大學實驗動物科提供，合格證號：SCXK（吉）2011-0007。八物君子湯的8味藥材均購自延吉市中醫醫院。烏頭堿（美國Sigma公司）CX40和CX43多克隆抗體（美國Abcam公司）、辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗（北京中山生物技術公司）；ANP檢測試劑盒為北京北方生物技術研究所產品（批準號S10950156）。

1.2 制備八物君子湯提取物

取人參100 g、黃芪、白術、白芍、當歸、川芎、陳皮、甘草各50 g切碎，分2次煎煮，每次加入10倍量的水，煎煮2 h，將2次濾液混勻，用旋轉蒸發儀進行濃縮。凍干后，最終獲得黃褐色粉末狀藥物，并儲存于-20℃冰箱內備用。

1.3 急性房顫模型的制備

用20%烏拉坦將雄性SD大鼠麻醉，快速開胸摘取心臟，并剝離左心房，將其固定在Choi等研制的離體搏動心房灌流裝置中。同時給予1.5 Hz的電刺激（電刺激時間為0.3 ms；電壓為30 V）來維持體外左心房搏動，用氧飽和的HEPES緩沖液[pH 7.4；（mmol·L-1）：NaC1 118，KC1 4.7，CaC12 2.5，MgC1 1.2，NaHCO325，葡萄糖10，HEPES 10，牛血清白蛋白 0.1%]對左心房組織進行持續性灌流，灌流約60 min心房搏動可達到穩定狀態。急性房顫模型是在心房灌流模型建立后，先經過1個正常對照循環（12 min）灌流后，繼以烏頭堿（6×10-7mol/L）誘發房顫的方法制備急性房顫模型，房顫以BL-420S生理記錄儀上顯示出現異常心跳波作為急性房顫模型成功的標志。

1.4 動物分組及藥物干預

選擇10只SD大鼠作為正常對照組，用氧飽和的HEPES緩沖液進行5個循環（60 min）的持續灌流。其余30只 隨機分為AI模型組（6×10-7mol/L）和AI+BJD高劑量組 （1×10-3g/mL）及AI+BJD低劑量組（3×10-4g/mL），每 組各10只。AI模型組在進行1個循環（12 min）正常灌流 后，進行4個循環（48 min）的烏頭堿藥物灌流；AI+BJD高低劑量組在進行1個正常循環（12 min）和2個循環 （60 min）BJD預處理后，在BJD持續灌流的狀態下給予2個循環（24 min）的烏頭堿進行灌流。

1.5 烏頭堿誘發房顫發生所需時間檢測

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預過程中，測定烏頭堿誘發房顫發生所需的時間變化的平均值。

1.6 心房灌流液中ANP分泌量變化檢測

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預過程中，測定第1（12 min）、第3（36 min）、第5（60 min）循環結束前4 min的ANP分泌水平變化的平均值。

1.7 心房組織內CX40、CX43蛋白表達檢測

采用Western-blot法檢測在急性房顫和藥物干預過程中心房組織內CX40、CX43蛋白水平變化。灌流實驗結束后迅速取出心房組織，稱重后將根據組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，并測定蛋白樣品的濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳分離后用半干轉移法將分離膠內的蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液封閉PVDF膜上的非特異性位點，并分別加入1∶200稀釋的兔抗大鼠CX40、CX43多克隆一抗（美國Abcam公司），在4℃孵育過夜，洗滌后續加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，在室溫下孵育1h后洗膜。采用圖像分析系統曝光成像并分析圖像，以-actin為內參，計算CX40、CX43蛋白的相對表達含量。

1.8 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料均以“±s”表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 烏頭堿誘發房顫及藥物干預后房顫發生所需時間變化的影響

各組大鼠在建立急性房顫模型和藥物干預過程中測定房顫發生所需時間變化，發現BJD高、低劑量組均比AI模型組烏頭堿誘發房顫所需的時間明顯延長（P＜0.05）。BJD高劑量組結果中有4只大鼠沒有出現烏頭堿誘發房顫，即完全抑制了烏頭堿作用，而低劑量組則未出現完全抑制的結果，高低劑量組之間相比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 八物君子湯拮抗烏頭堿誘發房顫時對ANP分泌的影響

烏頭堿誘發房顫時心房明顯增加ANP分泌量（P＜0.05）；BJD預處理時均出現ANP分泌量上調的趨勢，尤其是高劑量組結果顯示具有明顯增加心房組織ANP分泌的作用（P＜0.05）；BJD高低劑量組預處理后，用烏頭堿誘發房顫，發現心房組織ANP分泌量明顯減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，BJD高劑量組對心房組織ANP分泌的抑制作用顯著高于低劑量組（P＜0.05）。

2.3 各組心房組織中對CX40、CX43蛋白水平變化的影響（見表1）

表1 各組心房組織中對CX40、CX43蛋白水平變化的影響（±s）

表1 各組心房組織中對CX40、CX43蛋白水平變化的影響（±s）

注：與正常對照組比較1）P＜0.05；與AI模型組比較2）P＜0.05；與AI+BJD低劑量組比較3）P＜0.05。

組別 劑量 CX40 CX43正常對照組 - 1.16±0.042 0.87±0.056 AI模型組 6×10-7mol/L 0.23±0.0581） 0.26±0.0671）AI+BJD低劑量組 3×10-4g/mL 0.55±0.0591,2） 0.41±0.0651,2）AI+BJD高劑量組 1×10-3g/mL 0.83±0.0671,2,3） 0.73±0.0621,2,3）

3 討 論

心臟即是泵血器官，又具有內分泌功能。ANP是心房組織分泌的，具有調節體內水鈉平衡和血液動力學及改善心肌重構等重要作用的肽類物質。研究表明，房顫上調心房組織對ANP分泌量，其機制可能與房顫時心房壓力持續增高，交感神經興奮性增強，激活血管緊張素Ⅱ受體，介導心房肌細胞產生增生和間質纖維化，進而造成心房體積變大，心房肌細胞結構重塑等病理過程有關[2，3]。本實驗中發現八物君子湯可有效降低因烏頭堿誘發房顫導致的心房組織對ANP分泌量，且呈濃度依賴性。本研究結果提示八物君子湯能有效改善房顫導致的心房組織損傷，故出現ANP分泌顯著減弱的狀況。

綜上所述，朝醫方八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘導的急性房顫的作用，其作用機制可能與抑制心房組織CX40、CX43蛋白表達水平密切相關。另外，八物君子湯成分比較復雜，其具體的藥效成分及作用機制還有待于進一步深入研究。

[ 1] 李 杰,李俊鋒,魏婷婷.黃芪苷Ⅳ對心律不齊大鼠的作用及其相關機制[J].廣東醫學,2016,37(14):2076-2079.

本文編輯：劉欣悅

R285.5

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ISSN.2095-6681.2017.03.70.02

吉林省教育廳“十二五”規劃項目（吉教科合字[2015]第49號）；吉林省衛生計生科研課題（NO：2014Q042）；延邊大學自然科學基金（延大科合字[2015]第10號）