粒細胞集落刺激因子對大鼠局灶性腦缺血的療效及其機制分析

吳嬋姬 陸正齊

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粒細胞集落刺激因子對大鼠局灶性腦缺血的療效及其機制分析

吳嬋姬 陸正齊

目的 探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)對大鼠局灶性腦缺血的療效及其相關機制。方法 采用改良線栓法建立永久性局灶性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠12只，并隨機分為2組，G-CSF組術后2 h用G-CSF行皮下注射干預，對照組行PBS干預，采用t檢驗比較組間術后24 h腦梗死灶的體積差異(TTC染色法)和炎癥及趨化因子TNF-α、TGF-β、IL-10、MCP-1 mRNA水平(RT-PCR法)和CD11b分子的表達(免疫組織化學染色法)水平差異。結果 G-CSF組比對照組梗死體積減小19.6%(P=0.001)；G-CSF組MCP-1mRNA水平較對照組減少約22%(P=0.03)，G-CSF組IL-10 mRNA水平較對照組增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA則較對照組增高約1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2組間無明顯差異(P=0.88)；G-CSF組與對照組缺血區域的CD11b浸潤數目無明顯差異(P=0.61)。結論 G-CSF能顯著減少局灶性腦缺血的梗死體積，機制可能涉及TGF-β、IL-10、MCP-1等一系列重要的炎癥和趨化因子。

粒細胞集落刺激因子 局灶性腦缺血 療效 機制

缺血性腦卒中是最常見的中樞神經系統(central nervous system, CNS)疾病，是目前致殘和致死的主要原因之一，給社會和家庭帶來沉重的負擔，其中最常見的是大腦中動脈供血區的腦梗死，約占腦梗死的75%左右[1]。在急性腦梗死的治療中雖然超急性期組織纖溶酶原激活物和尿激酶的溶栓治療能取得明顯的療效，但溶栓治療時間窗小，并有其潛在的出血風險，限制了它的廣泛應用[2]。近年來以神經干細胞(neural stem cells, NSCs)和造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)為主的細胞替代治療也取得較明顯的療效，但NSCs的不易獲得性和HSCs來源上的倫理問題以及移植存在的免疫排斥、感染等一系列問題限制了這類干細胞的發展與應用，因此利用藥物刺激增強自體內源性干細胞的修復功能成為新的研究靶向熱點[3]。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)作為內源性HSCs的強力動員劑在CNS疾病的治療中引起了研究者極大的關注[4]。研究表明給予G-CSF治療能刺激內源性神經再生，動員骨髓干細胞入血并遷移入腦，促進神經再生與神經功能的修復，同時還能促進新生血管形成，在腦梗死的動物模型中取得了良好的療效，但對其機制的研究至今尚無明確結論[5]。因此，本研究擬通過建立大鼠永久性局灶性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型來闡明G-CSF在大鼠永久性局灶性腦缺血模型中的療效以及G-CSF是否通過調節重要的趨化因子單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的表達及T細胞免疫功能來影響炎癥過程和發揮保護作用，為G-CSF的臨床應用提供更進一步的基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 大鼠MCAO模型建立

選取SPF級健康成年雄性SD大鼠(購于廣東省實驗動物中心，動物合格證號：0027097、0028590、0028629)，體重250～300 g，用改良線栓法[6]建立大鼠MCAO模型；建模后采用5分制評分標準(無神經損傷癥狀為0分；不能完全伸展對側前爪為1分；向對側轉圈為2分；向對側傾倒為3分；不能自發行走、意識昏迷為4分)對模型大鼠進行評分，≥1分者為建模成功并入組實驗，最終共計納入12只MCAO模型大鼠。

1.2 分組與干預

隨機將MCAO模型大鼠平均分為2組：A組(G-CSF組)在大鼠MCAO術后2 h給予G-CSF(50 ug/kg)單次皮下注射治療1次；B組(對照組)在大鼠MCAO術后2 h給予同等體積的PBS代替G-CSF進行皮下注射治療。所有大鼠在術后24 h取腦組織行RT-PCR及免疫組織化學等檢測。

1.3 G-CSF的療效評價

療效評價通過測定腦梗死體積決定，G-CSF組與對照組各6只，MCAO術后24 h迅速斷頭取腦，-20 ℃冰箱中速凍15～20 min后腦托固定，冠狀切腦片(2 mm厚)，放入2%TTC中37℃避光染色30 min，正常腦組織染成玫瑰紅色，梗死組織不被染色呈白色，將腦片移入4%多聚甲醛固定過夜，掃描染色后的腦片用Image J圖像分析軟件計算梗死體積。計算公式：校正梗死體積=梗死體積×[1-{(梗死側半球體積-對側半球體積)/對側半球體積}]。

1.4 炎癥和趨化因子測定

采用實時RT-PCR方法測定MCAO術后24h大鼠腦組織缺血區域TNF-α、TGF-β、IL-10等炎癥相關因子及趨化因子MCP-1 mRNA的表達水平，采用免疫組化方法檢測MCAO術后24 h中性粒細胞表面標記CD11b在大腦缺血區中的表達情況。RT-PCR的引物設計見表1。所有實驗均參照標準的實驗規程進行。

表1 RT-PCR的引物設計

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 G-CSF治療后MCAO大鼠腦梗死體積的變化

G-CSF治療后大鼠MCAO術后24h梗死體積較對照組明顯減小，對照組梗死體積為(340.8±19.4) mm3，G-CSF治療后減小為(274.0±30.0) mm3，G-CSF組比對照組梗死體積減小19.6%(P=0.001)，(圖1)。

圖1 TTC染色測定腦梗死體積

2.2 G-CSF治療后MCAO大鼠病灶內趨化因子和炎癥因子的表達變化

G-CSF組MCP-1mRNA水平較對照組減少約22%(P=0.03)，G-CSF組IL-10 mRNA水平較對照組增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA則較對照組增高約1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2組間無明顯差異(P=0.88)(表2)。

表2 缺血區腦組織炎癥相關因子mRNA的 相對表達水平比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，▲P<0.01

2.3 G-CSF治療后缺血區域腦組織中性粒細胞浸潤的改變

G-CSF組與對照組缺血區域的CD11b浸潤數目無明顯差異(32.83±5.67個/每個400倍視野vs. 30.83±7.30個/每個400倍視野,P=0.61)(圖2)。

圖2 免疫組化方法檢測顯示，MCAO術后24h缺血區腦組織CD11b浸潤情況(×400倍)(黃色箭頭所示為陽性細胞) A為G?CSF組，B為對照組

3 討 論

由于腦組織對缺血缺氧的高度敏感性，在急性腦梗死的過程中組織發生一系列的病理生理改變，細胞出現壞死與凋亡，并發生一系列的炎癥過程，包括促炎因子的表達、內皮細胞粘附分子與趨化因子的表達增加、小膠質細胞與巨噬細胞的活化、白細胞的浸潤，T細胞在腦梗死的炎癥反應過程中通過炎癥相關因子的調節發揮重要的作用[7]。早期的研究認為G-CSF在多種條件下能減少多種炎癥因子的表達水平[8]。本研究探討了G-CSF對腦梗死后梗死灶體積影響及相關炎性趨化因子的影響，結果顯示G-CSF在治療大鼠MCAO模型時可顯著減小腦部梗死灶體積，并且使抗炎因子IL-10、TGF-β增加，MCP-1的表達減少，但對促炎癥因子TNF-α的表達和缺血區域中性粒細胞(CD11b標志)的表達無明顯影響，提示了G-CSF在腦梗死中特殊的抗炎特性。

IL-10作為一種抗炎因子能抑制許多促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-8的產生，在體外研究中IL-10能保護脂多糖/γ干擾素引起的少突膠質細胞的死亡，并抑制iNOS的表達[9]。與IL-10類似，TGF-β在此扮演的生物學角色可能也為抑制免疫活性細胞的增殖和抑制多種炎癥細胞因子的產生[10]。MCP-1是半胱氨酸趨化因子家族成員之一，在腦缺血發生后MCP-1表達增加，并在巨噬細胞在向腦缺血部位的遷移過程中起重要作用[11]，并且MCP-1能使單核細胞產生的IL-1、IL-6表達量增加，加重炎癥反應和組織的損傷，使梗死體積擴大[12]。本研究認為G-CSF在大鼠MCAO模型中的抗炎作用主要是通過增加IL-10和TGF-β、減少MCP-1在病灶內的表達來發揮其對腦梗死的保護作用。另外，本研究認為中性粒細胞的浸潤并未因使用G-CSF而得到抑制，這與早期Lee等研究結果提示G-CSF治療能減少腦缺血后中性粒細胞的浸潤的結果[13]不相符，考慮原因可能是樣本量和實驗方法的差異所致。TNF-α作為重要的促炎因子[14]，在IL-10和TGF-β都增加的情況下并不能明顯抑制它的表達，考慮可能原因是在腦梗死的病理機制中存在其它可促進細胞分泌TNF-α的通路。

綜上所述，本研究初步明確了G-CSF在急性腦梗死治療中的安全性和有效性以及可能涉及的機制，為臨床G-CSF在急性腦梗死中的應用提供了基礎理論參考，但該研究樣本量小，降低了檢驗效能，因此期盼納入更多的模型小鼠進行試驗，更希望進一步的大規模多中心隨機雙盲臨床研究來證實G-CSF在治療急性腦梗死中的價值。

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(2016-06-21收稿)

The Effect and Mechanism of Granulocyte-Colony Stimulating Factor in Focal Cerebral Ischemia of Rat

WuChanji，LuZhengqi.

DepartmentofNeurology,HainanProvincialPeople’sHospital,Haikou570311

Objective To explore the effect and mechanism of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) in focal cerebral ischemia of rat.Methods Modified suture method was used to establish a permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) model in 12 rats, which were then randomly divided into two groups (G-CSF group, after 2 h line with G-CSF subcutaneously intervention and the control group, underwent PBS intervention), t tests were used to compare the cerebral infarction after 24 h (TTC staining), mRNA levels of inflammatory chemokines including TNF-α, TGF-β, IL-10, and MCP-1 (RT-PCR method), and expression level of CD11b (immunohistochemically staining) between the two groups.Results G-CSF group had reduced infarct volume of 19.6% compared with control group (P=0.001); MCP-1 mRNA levels inG-CSF group was the 78%-fold of that in control group(P=0.03); IL-10 mRNA levels in G-CSF group was the 147%-fold of that in control group (P=0.01), and TGF-β mRNA in G-CSF group was 1 fold higher than that in the control group (P<0.01), but TNF-α mRNA levels between the two groups was not statistically significant (P=0.88); no difference in the number of infiltrating CD11b in ischemic area between the two groups was found (P=0.61).Conclusion G-CSF can significantly reduce infarct volume after focal cerebral ischemia; the mechanisms may involve TGF-β, IL-10, MCP-1 and a series of important inflammatory and chemokines.

Granulocyte-colony stimulating Factor Cerebral ischemia Effect Mechanism

570311 海口，海南省人民醫院神經內科(吳嬋姬)；中山大學附屬第三醫院神經內科(陸正齊)

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0095-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.003