血管生成對慢性低灌注狀態下血腦屏障及腦白質損害的影響

林瑯 黎紅華 武強 駱文靜

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血管生成對慢性低灌注狀態下血腦屏障及腦白質損害的影響

林瑯 黎紅華 武強 駱文靜

目的 了解腦血管生成是否參與腦白質區域慢性低灌注狀態下血腦屏障的破壞機制。方法 將72只雄性Wistar大鼠隨機分為3組：假手術組、腦缺血組、干預組，腦缺血組及干預組大鼠結扎雙側頸總動脈構建慢性低灌注模型，干預組給予血管生成抑制劑灌胃以抑制血管生成；對各組大鼠在相同時間點檢測腦深部白質區域微血管密度、白質纖維密度以及伊文思藍靜脈注射6 h后腦白質區域組織內伊文思藍水平。結果 腦缺血組及干預組大鼠腦白質區域血管密度和伊文思藍濃度均顯著高于假手術組，白質纖維密度顯著低于假手術組，干預組微血管密度、白質纖維密度及腦組織內伊文思藍水平顯著低于腦缺血組。結論 慢性低灌注誘導的血管生成可能導致血腦屏障通透性增加，但血管生成有助于減輕白質損傷，但這種保護作用大于血腦屏障通透性改變帶來的不利影響。

腦缺血 血腦屏障 血管生成 白質損害

慢性低灌注狀態被認為是引起腦白質損害、血管性癡呆的原因之一[1-2]。有研究表明慢性低灌注狀態下血腦屏障破壞可能參與腦組織損傷機制[3-4]。研究表明，血管生成(angiogenesis)可導致血腦屏障破壞，而缺血、缺氧則是誘導血管生成的重要因素[5]。我們此前的研究也表明，在慢性低灌注狀態下白質區域的血管生成水平上調，血腦屏障發生破壞[6]，提示血管生成所引起的血腦屏障破壞可能為缺血性腦白質損害的發病機制之一。本研究目的在于闡明抑制慢性低灌注狀態所致血管生成是否可起到保護血腦屏障，減輕腦白質損害的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級Wistar大鼠72只，體重250～300 g，購自軍事醫學科學院。

1.2 主要試劑與儀器 索拉菲尼(sorafenib，由德國拜耳公司提供)，熒光素異硫氰酸酯標記葡聚糖、Luxol固藍、焦油紫(購于美國Sigma公司)，伊文思藍、三氯乙酸、碳酸鋰(購于北京化學試劑公司)，VT1000S腦組織振動切片機(購于德國Leica公司)，C1-SI激光掃描共聚焦顯微鏡(購于日本Nikon公司)，RF-540熒光分光光度計(購于日本Shimadzu公司)。

1.3 大鼠分組及干預 將72只大鼠隨機分為假手術組、腦缺血組、干預組各24只，每組大鼠根據檢測內容分為血管密度亞組、白質纖維密度及血腦屏障亞組各8只。將大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口切開皮膚，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌，暴露頸總、頸內、頸外動脈，并分離頸總動脈和迷走神經。腦缺血組與干預組結扎頸總動脈，假手術組不結扎，縫合皮膚。術后3組大鼠同條件飼養，干預組大鼠每日予血管生成抑制劑-索拉菲尼混懸液2 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術組及腦缺血組大鼠每日予生理鹽水1 mL灌胃。術后第30 d將大鼠根據不同檢測目的分別按下述方法處理。

1.4 血管密度檢測 大鼠處死前予熒光素異硫氰酸酯標記葡聚糖50 mg靜脈注射，1 h后迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內保存24 h后取前囟前2-4 mm區域腦組織振動切片機冠狀位切片，片厚100 um。按Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》確定腦深部白質區域，激光掃描共聚焦顯微鏡下對腦深部白質取600 μm×600 μm區域行逐層掃描，每層間隔1 μm，共掃描50層。將掃描圖像導入3D Doctor 3.5圖像分析軟件，利用該軟件對腦血管進行三維重建并計算三維空間內血管容積，將血管容積除以三維空間總容積得到血管密度。

1.5 Kluver-Barrera髓鞘染色 大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，開胸，剪開右心耳后經左心室快速灌注4%多聚甲醛溶液250 mL，斷頭取腦；腦組織于4%多聚甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，取前囟后2～4 mm處腦組織冠狀位4 μm切片；每只大鼠取3張切片，將切片脫蠟水化至95%酒精，0.2% Luxol固藍溶液60 ℃過夜，95%酒精沖洗后蒸餾水洗，0.05%碳酸鋰溶液30 s，70%酒精洗，0.1%焦油紫溶液1 min，70%酒精洗，脫水、透明、封片。用Image pro plus 6.0軟件分析深部白質纖維密度。

1.6 血腦屏障破壞檢測 大鼠處死前予2%伊文思藍4 mL/kg靜脈注射，6 h后經左心室予0.9%氯化鈉注射液500 mL快速灌注，斷頭取腦，取前囟后2～4 mm處腦組織，稱重后置入1 mL 50%三氯乙酸溶液內，經勻漿、離心后上清液予3 mL無水乙醇稀釋，采用熒光分光光度計測定其熒光強度(激發波長620 nm，釋放波長680 nm)，根據預先測定的標準曲線測定伊文思藍水平并計算腦組織內伊文思藍水平。

2 結 果

2.1 血管密度測定 腦缺血組及干預組血管密度均較假手術組增高(P<0.05)；干預組血管密度較腦缺血組減低(P<0.05)(表1、圖1～3)。

2.2 腦深部白質纖維改變情況 假手術組深部白質纖維排列致密，走行一致，無脫髓鞘現象(圖4)；腦缺血組及干預組大鼠深部白質纖維排列松散，走行較紊亂，有較多空泡，脫髓鞘現象明顯(圖5～6)。腦缺血組和干預組深部白質纖維密度均較假手術組顯著降低(P<0.01)，干預組深部白質纖維密度較缺血組降低(P<0.05)(表1)。

2.3 血腦屏障破壞檢測 腦缺血組及干預組伊文思藍水平均較假手術組顯著增高(P<0.01)，干預組大鼠伊文思藍水平較腦缺血組降低(P<0.05)(表1)。

表1 3組大鼠相關檢測指標比較)

注：與假手術組比較，*P<0.01，▲P<0.05；與腦缺血組比較，△P<0.05

3 討 論

腦白質疏松是血管性認知功能損害的重要病理表現之一，白質疏松的嚴重程度和認知功能惡化相關。許多研究表明白質疏松和不完全性缺血(低灌注狀態)有密切聯系[7]。目前對缺血性腦白質損害的機制尚未取得共識，但已有的研究提示血腦屏障破壞可能是缺血性腦白質損害的關鍵環節之一[8]。Binswanger病患者腦白質血腦屏障通透性增高多發生于白質損害區域邊緣部位，提示血腦屏障破壞可能是白質損害的基礎之一[9]。

圖1 假手術組血管密度正常 圖2 腦缺血組血管網密度明顯增加,走行較紊亂 圖3 干預組血管網密度有所增加(標尺=50μm) 圖4 假手術組大鼠深部白質纖維排列致密,走行一致,無脫髓鞘現象 圖5 腦缺血組 圖6 干預組

血管生成(angiogenesis)在缺血性血腦屏障破壞的發生機制中有重要地位。大量研究表明，血管生成過程中的許多重要因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等均可顯著升高腦血管內皮細胞的通透性[10]。VEGF不僅和缺血狀態下血腦屏障破壞有關，還和炎癥等病理狀態下的血腦屏障破壞相關[11]，這可能提示在這些病理狀態下血腦屏障的破壞有著共同的發病環節。此外，基質金屬蛋白酶也與急性腦缺血損害時血腦屏障的破壞有密切聯系[12]。缺血、缺氧是引起血管生成的主要始動因素，因此慢性低灌注狀態下血管生成水平很可能被上調，從而成為慢性低灌注狀態下血腦屏障破壞的機制之一。

自被發明以來大鼠雙側頸內動脈結扎模型被驗證為一種成熟可靠的腦慢性低灌注模型并得到廣泛應用。多項研究證實在雙側頸內動脈結扎所致的慢性低灌注情況下大鼠腦白質會發生明顯的脫髓鞘情況。本研究缺血組腦白質纖維密度較假手術組降低，這與相關文獻報道一致。我們此前的研究也已表明，在慢性低灌注狀態下大鼠腦內VEGF mRNA表達增多，血管生成水平上調，血腦屏障發生破壞[6]，這在本研究中同樣得到了體現。

本研究采用了索拉菲尼(sorafenib)作為血管生成抑制劑，索拉菲尼是一種小分子VEGF受體抑制劑，可通過抑制VEGF受體而產生抗血管生成作用[13]。給予索拉菲尼后慢性腦缺血大鼠的血管生成水平下調，血腦屏障通透性下降，從而進一步證實慢性低灌注狀態下血管生成可以提高血腦屏障通透性。但給予抑制血管生成劑的大鼠的腦白質損害較缺血組加重，表明抑制血管生成所得到的血腦屏障通透性下降并沒有起到減輕腦白質損害的效果。這是因為血管生成可能對大鼠的腦白質損害存在多重作用機制，一方面它帶來的血腦屏障破壞可能參與腦白質損害的發生；另一方面血管生成可能使局部血供改善，從而起到保護白質纖維的作用；相比之下，血管生成對腦白質的保護作用大于其帶來的損害效應。因此，在保護腦低灌注區域的血管生成同時抑制其帶來的血腦屏障的不利影響可能會有助于減輕低灌注狀態下的腦白質損害。

盡管本研究預期通過抑制血管生成所導致的血腦屏障破壞，從而減輕腦缺血狀態下腦白質損害的目標未能實現，但本研究的結果進一步闡明了慢性低灌注下血管生成和血腦屏障破壞間的聯系以及血管生成對缺血性腦白質損害的保護價值。這對于進一步探索血管生成對缺血性腦白質損害保護作用機制以及保護血腦屏障對于缺血性腦白質損害的價值有提示意義。

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(2016-10-16收稿)

The effect of angiogenesis on blood-brain barrier disruption and white matter damage under chronic cerebral hypoperfusion status

Lin Lang, Li Honghua, Wu Qiang, et al.

Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Army, Wuhan 430070

Objective To estimate the influence of angiogenesis on blood-brain barrier damage mechanism under chronic cerebral hypoperfusion status of white matter.Methods Seventy-two male Wistar rats(250-350 g) were divided into three groups: sham-control group, ischemia group and anti-angiogenesis group. Permanent and bilateral common carotid artery occlusion was used to induce hypoperfusion of forebrain in the ischemia group and anti-angiogenesis group, and oral gavage with souvenir was used for anti-angiogenesis administration. Capillary density, Kluver-Barrera's myelin sheath staining and quantitative measurement of Evans Blue were made at the 30th day after the operation.Results Compare to the sham-control group, the ischemia group and anti-angiogenesis group had higher capillary density, higher concentration of Evans Blue and lower density of white matter fibers. The capillary density, the concentration of Evans Blue and the density of white matter fibers in the anti-angiogenesis group were much lower than those in the ischemia group.Conclusion The angiogenesis induced by chronic cerebral hypoperfusion states could lead to blood-brain barrier disruption. However, the protective effect of angiogenesis on white matter overwhelmed the bypass adverse effect of subsequent blood-brain barrier disruption.

Brain ischemia Blood-brain barrier Angiogenesis White matter impairment

430070 武漢，廣州軍區武漢總醫院神經內科

R743.3

A

1007-0478(2017)03-0181-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.003