急性腦梗死患者TLR4/NF-κB信號通路水平與腦血流量的相關性研究

顧紅梅 邵陽

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急性腦梗死患者TLR4/NF-κB信號通路水平與腦血流量的相關性研究

顧紅梅 邵陽

目的 評價急性腦梗死患者血清中toll 樣受體4(TLR4)和核轉錄因子(NF-κB)信號通路水平與腦血流量的相關性。方法 選取在本院接受治療的100例大腦中動脈(MCA)供血區域腦梗死患者作為試驗組，再選取同期接受體檢健康的100例正常人作為對照組，采用免疫組織化學方法檢測2組患者的TLR4和NF-κB水平，分析2組研究對象的大腦前動脈(ACA)、MCA收縮期血流峰值與TLR4、NF-κB的相關性。結果 試驗組ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于對照組(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而試驗組MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于對照組(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)。試驗組TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于對照組TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)；TLR4及NF-κB水平與ACA血流速度呈正相關，與MCA血流速度呈負相關(P<0.05)。結論 急性腦梗死患者MCA、ACA血流峰值與TLR4及NF-κB水平存在相關性。

急性腦梗死 toll樣受體4(TLR4) 核轉錄因子(NF-κB)

Toll樣受體家族(toll like receptors, TLRs)在腦缺血再灌注損傷過程中炎癥介質和炎癥應答的產生起到重要作用，其中TLR4的研究最為深入[1]。核因子-κB(NF-κB)作為最重要的核轉錄因子之一，參與了諸多炎性反應、細胞凋亡等生理和病理過程，NF-κB的活化及移位導致TLR4/NF-κB信號通路下游多種促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，是TLR4反應通路中關鍵性轉錄因子[2]。大量研究已經指出TLR4/NF-κB信號通路在腦梗死患者發病過程中存在的意義與影響，對于其早期診斷的意義十分重大，但具體的作用方式仍處于爭議狀態[3-4]，Song[5]認為TLR4/NF-κB損傷血管內皮導致血流量下降可能是主要原因。為進一步明確TLR4/NF-κB信號通路相關因子水平對急性腦梗死患者腦血流量的影響，本研究選取部分患者與健康人群進行對比，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年12月～2015年12月在本院接受治療的急性腦梗死患者作為試驗組，納入標準：所有患者均以第四屆全國腦血管病學術會議中的《各項腦血管病診斷標準》為診斷依據[5]，以頭顱MRI和MRA為診斷金標準，確診為大腦中動脈(MCA)供血區域腦梗死患者；所有患者均自愿參與調查研究，且患者均在發病24～48 h內；至醫院行TCD、CT檢查均證實為腦梗死的患者；不存在其他心理疾病的患者，且所有患者及其家屬均簽署知情同意書。排除標準：排除有顱內感染、神經精神疾患、身體衰弱、顱內占位性病變、脊髓病變、中毒等患者；入院前患有嚴重的代謝性疾病或是內科疾病，同時包括服用一些藥物而影響免疫功能的患者；病程相對較長，不屬于急性發作的患者。符合入選標準的患者100例，再選取同期接受體檢健康的100例正常人作為對照組。2組的年齡、性別等比較無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 2組人口學和病史比較

1.2 方法

1.2.1 TLR4/NF-κB水平測定

首先在患者進行標本采集前6 h禁食和飲水，并在血液標本采集當天清晨空腹情況下采集肘部靜脈血8 mL，其中肝素抗凝管中取6 mL血液標本，混合均勻；采用Ficoll液體分層法將血液分離提純后取其單個核細胞(PBMCs)，其余2 mL靜脈血標本放入不含抗凝劑的試管中，在溫室環境中放置，待其凝固后分離得到血清，于20℃環境下進行冷凍保存；應用瓊脂糖凝膠電泳及半定量技術對TLR4實施檢測；采用免疫組織化學技術對NF-κB水平進行檢測[6-7]。

1.2.2 經顱彩色多普勒血流顯像(CDFI)檢查

兩組采用德國西門子ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀，探頭型號4V1c，頻率2.0 MHz；將探頭置于顳窗檢測大腦前動脈(ACA)與MCA血流情況，記錄3次平均血流速度，每次2 min，取3次的平均值作為腦血流速度的測定值，所有檢查均由本科同一名高年資影像學醫師進行。

2 結 果

2.1 2組患者的收縮期峰值情況

試驗組ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于對照組(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而試驗組MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于對照組(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)(表1)。

表1 2組患者的收縮期峰值比較,cm/s]

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 2組TLR4及NF-κB水平比較

試驗組TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于對照組TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)(表2)。

2.3 相關性分析 Pearson相關分析表明，TLR4及NF-κB水平與ACA血流速度呈正相關(r=0.448、0.531，P<0.05)，與MCA血流速度呈負相關((r=-0.502、-0.403，P<0.05)(表3)。

表2 2組TLR4及NF-KB水平比較，ng/mL]

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 TLR4及NF-κB水平與ACA及MCA血流速度的相關性分析

3 討 論

近幾年來腦梗死的發病人數不斷增多，且多數患者為急性發病，致殘率與致死率均較高，如若不能早期發現、早期診斷、早期進行治療會對機體造成永久性的不可逆性傷害。急性腦梗死患者的發病原因不一，大多數患者腦梗死的急性發病均與含有細胞參與的急性炎癥反應以及與患者機體發生缺血再灌注所遭受的血管損傷有十分密切的關系[8]。TLR4是第一個被發現的哺乳動物TLRS，位于9q32-33，除可在單核細胞、血管內皮細胞等表達，還可在母嬰界面廣泛表達，它可同時識別外源性配體如脂多糖(LPS)及內源性配體如高遷移率族蛋白1等，Toll/IL-1受體(TIR)是細胞內信號轉錄的起始部位，主要是通過髓樣分化因子MyD88依賴性信號轉導和NF-κB激活細胞因子轉錄而介導炎癥反應。

TLR4在中樞神經系統也有廣泛表達，且細胞載體一般為小膠質細胞類型，一旦患者腦組織中出現炎癥反應，TLR4將被激活并發揮較強的抑制炎癥反應的作用，因此其是小膠質細胞的免疫執行過程中的一種關鍵信號之一[9-10]。不僅如此，TLR4在機體的腦血管細胞中其內皮細胞表面、脈絡叢、終板等也存在一定程度的表達。在急性腦梗死發病后腦組織中血液循環狀態差，且氧氣供應不足，導致腦血管中內皮部分通透性發生改變，使腦組織中的壞死物質得到了釋放，并且吸引淋巴細胞、巨噬細胞等凝集，進而促進效應細胞的炎癥反應，這幾種細胞均能使TLR4得到充分的表達[11-12]。TLR4作為一種十分重要的炎性受體類型，能夠對機體炎性損傷進行介導，對細胞內的信號轉導有啟動的作用，并且通過核因子(NF-κB)等途徑激活炎癥細胞，對粘性因子與炎性因子產生作用，使其得到大量的表達，促發機體內的炎性反應[13]。同時，TLR4也是腦缺血后產生炎性損傷的效應分子類型，本研究中急性腦梗死發病后的患者TLR4水平比正常人明顯增多，同時血流量明顯下降；Wang[14]推測其機制可能是血管內皮損傷時血小板表達CD34+增加，TLZR、TL4R信號途徑與P3I K/Akt信號通路相互交聯，通過GSK-3β和mTOR下游信號通路與C反應蛋白(CRP)相互作用，促使血管內皮損害進一步加重，促使動脈結構變化、動脈纖維化和動脈僵硬，致病變區域MCA血流峰速下降，而ACA血流上升屬于代償性現象。

急性腦梗死患者的機體中NF-κB發生活化反應，可以作為TNF-α等多種不同物質的轉錄激活因子，是大腦組織中多種信號通路的一個聚集點，通過對各種物質或因子轉錄過程中水平的調節來控制轉錄的過程，進而發揮臨床作用[15-16]。隨著醫學技術水平的不斷發展，已經明確細胞因子轉錄網絡與NF-κB之間存在較大的聯系，幾種物質共同參與腦梗死急性發病的過程[17]。相關研究進一步表明，細胞因子的啟動含有2個NF-κB的結合位點，調節各種物質的轉錄過程，當腦梗死發生時患者的轉錄因子被激活，NF-κB水平增加，導致腦組織中部分細胞發生異常變化，致使患者動脈血管內皮受損，最終發展成為腦血管閉塞，腦組織血流灌注減少至消失，缺血缺氧程度加重等[18]，但也有學者認為血流量下降才是NF-κB激發的始動因素[19]，兩者的因果關系有待進一步研究。

綜上所述，急性腦梗死患者MCA、ACA血流峰值與TLR4及NF-κB水平存在相關性，但兩者的因果關系需要更多研究證實。

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(2016-10-18收稿)

The relation of TLR4/NF-κB cytokines signaling pathway and cerebral blood flow in patients with acute cerebral infarction

Gu Hongmei, Shao Yang.

Department Of Neurology, The second Hospital Affiliated Nanjing Medical University, Nanjing 215002

Objective To evaluate the correlation between the serum toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear transcription factor (NF-κB) signaling pathway factor levels and cerebral blood flow in acute cerebral infarction patients.Methods 100 middle cerebral artery(MCA) obstruction cerebral infarction patients (the test group) were selected in our hospital. And then 100 normal healthy cases(the control group) were chosen. The level of TLR4 and NF-κB were detected by using the immunohistochemical. The correlation between the systolic peak in anterior cerebral artery(ACA), MCA and TLR4, NF-κB were analyzed in two groups.Results The ACA peak flow (55.54±4.22) cm/s was higher in the test group than that (48.65±3.54) cm/s in the control group (t=9.145,P<0.001), while the MCA peak flow (132.45±5.65) cm/s were lower in the test group than that (141.54±3.54) cm/s in the control group (t=8.436,P<0.001). TLR4 and NF-κB levels (4.29±0.46) ng/mL, (144.43±23.67) ng/mL were higher in the test group than those TLR4 (3.65±0.57) ng/mL and NF-κB (115.63±24.45) ng/mL in the control group (t=5.861, 5.677,P=0.012, 0.0018). TLR4 and NF-κB levels were positively correlated with ACA blood flow velocity, negatively correlated with MCA flow velocity (P<0.05).Conclusion There was a correlation between MCA, ACA peak flow and TLR4, NF-κB level in patients with acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction Toll-like receptor 4 (TLR4) Nuclear factor KB (NF-κB)

210000 南京醫科大學第二附屬醫院神經內科[顧紅梅 邵陽(通信作者)]

R743.32

A

1007-0478(2017)03-0197-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.007