DNA條形碼鑒定研究

劉 莉、張仕林、楊 飛*、沈開文、王 迅

（貴州漢方藥業貴州省貴陽市，貴州 貴陽 550000）

DNA條形碼鑒定研究

劉 莉、張仕林、楊 飛*、沈開文、王 迅

（貴州漢方藥業貴州省貴陽市，貴州 貴陽 550000）

目的 探究應用DNA條形碼對大黃類藥物分類的效果。方法 提取四川、甘肅、青海、西藏、云南、寧夏6省份的40份樣品葉綠體matK基因序列進行PCR擴增，將不同產地大黃的matK基因進行對比，以進行鑒定工作。結果 將提取的基因序列進過嚴格仔細的對比，能夠發現40類樣品中細微的差別。結論 通過DNA條形測序工作可以對大黃進行明確的品種分類。

大黃；matK基因

大黃有非常實用的臨床藥效，在中醫臨床中有廣泛的應用，其主要的功效為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃等。正品大黃為蓼科大黃屬的唐古特大黃、掌葉大黃或者藥用大黃的根莖。近年來隨著需求量的增大，以及野生大黃數量的急劇下降，在藥材市場流通有大量的假冒偽劣產品。中藥材的鑒別一直是一個熱門的話題，人們長期尋找一種準確的鑒別方法。以前大多數是經有經驗的藥師通過外觀、氣味等方面進行鑒別。這就有非常的主觀性，準確率比較低。今年來隨著基因學的發展，人們通過對大黃基因學的研究，發現可以通過DNA序列的對比，可以對大黃進行準確的鑒別和分類。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取產自四川、甘肅、青海、西藏、云南和寧夏6個省份的40份樣品進行鑒定。這些樣本經過專家鑒定為大黃，并保存相應的樣本以備查驗。

1.2 方法

從大黃藥材根部中間部位選取20 mg，放入研磨器材中，加入液氮經過充分的研磨成粉狀。然后用廣譜植物基因提取試劑盒提取DNA，提取過程中進行充分的水浴，加入AP3緩沖液后高速離心1 min抽取上清液。將得到的DNA在-20℃的環境下保存待用。

用上海生工生物工程技術有限公司生產的由日本研發的3對引物，將目的基因進行PCR的擴增。引物信息以及退火溫度詳見表一。反應體系的構成：滅菌ddH2O 30 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCl24 μL，dNTP4μL，引物各2 μL，DNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶lμL。按照預先設計好的擴增程序進行PCR擴增。具體步驟為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，總共進行35個循環。將擴增的結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送到上海生工生物工程技術有限公司進行測序[1]。

2 結 果

將所得的序列結果與文獻中提供的序列進行分析對比，將序列100%相同的歸為同一個基因組，有任何不同的視為不同基因型。某些樣品經過PCR擴增后檢測不到DNA，這可能是因為提取樣品純度不夠，雜質過多影響了引物和相應基因的結合所導致。對于未檢測到DNA的樣品進行進一步的純化后，再進過相同的流程得出了滿意的結果。經過基因學分析大黃的matK基因序列全長在1518 bp～1524 bp之間，總共發現57個變異點，各個品種間有顯著差異的特異位點區分。所有大黃的平均遺傳距離為0.0421，最大遺傳距離為0.4521，最小遺傳距離為0.0036[2]。

表1 本研究中所用PCR引物的基本資料

3 討 論

中藥材由于炮制過程以及純度的問題使得DNA的提取難度增大，有些研究中采用對ITS基因的擴增進行基因序列的研究，但是ITS除了大黃外，在一些真菌中的含量也十分的豐富。中藥材中常含有不同程度的真菌，因此該基因序列檢測的準確度大大降低。而本文中所采用的matK基因就很好的避免了這個問題，使檢測的準確性以及可靠性大幅度的增加。本文中的檢測樣品量還不是十分充足，因此應進一步的研究，以便達到更好的鑒定效果。

[1] 李美妮,韓蕊蓮,等.大黃與易混偽品土大黃、虎杖原植物的ITS2序列鑒定[J].環球中醫藥,2012,5(3):185-189.

[2] 張曉芹,劉春生,等.多基原藥材大黃葉綠體matK基因序列分析及鑒定研究[J].藥學學報,2013,48(11):1722-1728.

本文編輯：李 豆

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B

ISSN.2095-6681.2017.08.72.01

科學技術部重大新藥創制專項子課題（2014ZX09301308-007）：苗藥芪膠升白膠囊技術改造及再評價研究，負責人：劉 莉。貴陽國家高新區科技計劃項目（合同編號：GXKH2015-20）：芪膠升白膠囊處方藥材DNA條碼的建立項目

楊 飛，執業藥師，主要研究方向：中藥學。