移植腎排異背景下血清多反應性IgG對凋亡細胞反應性升高并激活補體途徑

賈 丹，榮春書，童 嵐，高寶山*

(1．吉林大學第一醫院，吉林 長春130021；2．長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130021)

*通訊作者

移植腎排異背景下血清多反應性IgG對凋亡細胞反應性升高并激活補體途徑

賈 丹1，榮春書2，童 嵐1，高寶山1*

(1．吉林大學第一醫院，吉林 長春130021；2．長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130021)

抗體介導的排異反應(Antibody mediated rejection，AMR)是腎移植后導致移植物失功的主要原因之一。而AMR的核心特征是受者循環中出現針對移植物的抗體，此類抗體包括移植前預存于體內的抗體以及移植后新生抗體。當抗體為特異性識別供者所表達的HLA抗原時則被稱為供者特異性抗體(Donor specific antibodies，DSA)，而當抗體識別的是自身表達的抗原時則被稱為自身抗體。 研究發現在AMR過程中另一種形式的抗體[1]表現出廣泛的反應性，此類抗體可以與多種毫不相關的抗原諸如雙鏈DNA、胰島素、磷酸脂多糖以及多態性HLA分子發生反應。通過分子實驗技術發現，其中一個單克隆的多反應性抗體由一個在循環中高度擴增的記憶性B淋巴細胞產生，而這個單克隆的B細胞占據了AMR患者外周血B細胞的0.2%。值得關注的是，AMR患者血清所識別的HLA位點恰好與這個高度擴增的B細胞克隆分泌的抗體所識別的HLA位點重合，此現象提示我們，多反應性抗體的存在可對腎移植患者總體血清反應性做出貢獻。

在小鼠中，多反應性抗體由B1細胞產生，B1細胞作為固有B細胞的一個亞群，初始位于腹膜腔內而并非淋巴組織，B1細胞被認為分泌“自然抗體”，這些抗體可與程序性死亡的細胞發生反應并參與它們的清除。本文研究AMR過程中產生的多反應性抗體對凋亡細胞作用，從而評估此背景下B1細胞的反應性。

另一個重要問題，即多反應性抗體的臨床意義及其在AMR中的作用。目前已經明確的是，DSA通過激活補體途徑介導移植物組織損傷，而補體途徑的激活可通過C4d分子沉積于移植物內膜細胞來揭示。本研究通過探索多反應性抗體是否也能激活補體途徑，從而評估其對AMR病理進程造成的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究所用血清樣本來源于：(1)腎移植術后移植腎功能正常的患者30例；(2)腎移植術后出現移植腎AMR的患者18例；(3)健康志愿者5例。其中，移植腎功能正常組患者與AMR組患者在性別構成、年齡、透析方式、移植前透析時間、原發病、體重指數、移植前誘導用藥、免疫抑制方案等方面均無統計學差異。

1.2 方法

1.2.1 凋亡細胞的制備 Jurkat細胞株0.5×106/ml與200 ng/ml抗FAS抗體于37℃孵育箱內共孵育15小時。Annexin-V及7-AAD(BD公司)染色以確認細胞凋亡。

1.2.2 血清IgG純化 將血清與純化緩沖液以1∶10混勻后加入預裝有吸附膠體及濾膜的純化容器，6000 rpm離心2 min，通過濾膜落入Eppendorf試管中的稀釋血清即純化后的IgG抗體，收集待用。

1.2.3 血清IgG對凋亡細胞的反應性 將分別從腎移植患者及健康志愿者血清中純化的IgG抗體與1×106誘導凋亡后的Jurkat細胞株混勻，37℃孵育30 min，低溫洗滌二次，分別向標本中加入FITC耦聯的抗IgG的二抗(Invitrogen公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，流式細胞儀檢測IgG對凋亡細胞的反應性。反應強度用平均熒光強度(MFI)表示。

1.2.4 C4d沉積實驗 0.5×106Jurkat凋亡細胞分別與60 μl稀釋成1∶2的純化血清IgG于37℃孵育15 min。Hank's平衡鹽以1∶100稀釋健康志愿者血清做為補體來源加入樣本，37℃孵育15 min。低溫洗滌，于反應體系中加入抗C4d二抗(Quidel公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，加入FITC耦聯的鼠抗人IgG二抗(BD公司)，4℃避光孵育30 min。低溫洗滌后用流式細胞儀檢測凋亡細胞表面C4d沉積情況。C4d沉積強度用MFI表示。

1.2.5 移植腎活檢組織C4d及活化caspase-3免疫熒光染色 來自2例AMR患者移植腎穿刺組織，連續冰凍切片風干30 min并于PBS液中漂洗，抗C4d抗體(1∶100，Quidel公司)及抗caspase-3抗體(1/50，BD公司)分別染色1 h，漂洗后加入羊抗兔IgG二抗(1/200，Vector公司)孵育30 min，漂洗后分別加入FITC-streptavidin (1/150，Vector公司)以及Cy3-streptavidin(1/5000，Jackson公司)。應用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察切片染色情況。

1.2.6 統計學方法 Student非配對t檢驗用以比較各組間血清IgG對凋亡細胞的反應性及補體激活能力，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清IgG對凋亡細胞的反應性比較

本研究分別檢測了健康志愿者、移植腎功能正?；颊?、AMR患者血清IgG對凋亡細胞的反應性，結果顯示(圖1)，分別與移植腎功能正常者及健康志愿者相比較，AMR患者血清IgG對凋亡細胞的反應性顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.0001，P=0.030)。

圖1 不同組別血清IgG對凋亡細胞的反應性

2.2 血清IgG對補體激活能力的比較

在移植腎功能異常的病例中，可通過檢測移植物組織中C4d的沉積來揭示是否有補體途徑的參與。本研究中，我們利用體外實驗檢測腎移植患者及健康志愿者血清IgG與凋亡細胞反應后能否激活補體途徑。如圖2所示，分別與移植腎功能正常者及健康志愿者相比較，AMR患者血清IgG與凋亡細胞反應后，具有更強的補體激活能力，導致C4d沉積于靶細胞表面的強度顯著增加(P=0.0033，P=0.038)。

圖2 不同組別血清IgG激活補體途徑的能力

2.3 移植腎活檢組織中C4d與活化caspase-3的共區域化現象

AMR的典型病理特征是補體代謝產物C4d的沉積，而活化的caspase-3是細胞凋亡的證據。我們體外研究證實，AMR患者血清中純化的IgG抗體可以與凋亡細胞反應并激活補體途徑。在移植腎組織中也觀察到了類似現象：對移植腎組織的熒光染色結果顯示，移植腎組織中C4d與活化的caspase-3的共區域化現象(圖3)，說明細胞凋亡與補體途徑的激活可共存于發生AMR的移植腎組織中。

圖3 移植腎組織C4d及caspase-3熒光染色

3 討論

有學者研究報道[1]在AMR過程中發現的一類抗體，既不是同種異體特異性也并非自身反應性的，這類抗體可與廣泛的抗原諸如核酸及多態性HLA分子發生反應，從而表現為多反應性。盡管既往對多反應性單克隆抗體的深度鑒定僅限于一個腎移植患者，但本研究將此發現擴展至其他AMR的患者。結果顯示，相對于移植物功能正常的患者，AMR患者血清中多反應性IgG的活性顯著升高。表明此類抗體作為免疫反應的組成部分與AMR相關。然而多反應性IgG的產生原因尚不明確。既往有報道[2]，自身抗體在細胞凋亡后可以與隱蔽抗原相結合，基于這個原因，我們不能排除部分多反應性抗體是由于單克隆自身抗體的存在所致。

多反應性抗體初始形式為IgM，其被認為是免疫系統中自身反應性的組成部分，也有研究發現類型轉換的多反應性IgG[3,4]，但多與病理過程相關。例如在系統性紅斑狼瘡中，多反應性IgM通過類型轉換變成IgG后可能具有致病作用[5]。多反應性IgM抗體如何轉換成致病性IgG尚不明確，但在多種環境下，自然抗體可因凋亡細胞的暴露而改變活性，AMR與移植腎多部位調亡細胞數量的增加密切相關，這個過程中凋亡細胞的爆發性增加可能觸發具有調亡細胞反應性的B細胞的類型轉換，如果這個假設正確，多反應性抗體可隨著移植物內細胞凋亡的進展而出現。

研究發現[1]，經歷AMR的患者血液中出現高頻度的B細胞克隆，這個高頻度表明此B細胞克隆在體內經歷了擴增，而這個過程與免疫球蛋白重鏈區的體細胞突變的累積以及相對應永生化B細胞克隆表達CD27記憶性標志是一致的。這個B細胞克隆也可與諸多自身抗原、HLA I類抗原以及凋亡細胞發生反應。我們認為這個B細胞克隆并非特例，而是具有代表性的一個克隆。這類記憶性B細胞在生理條件下可分泌自然抗體IgM。移植物排異反應過程中，在炎癥反應的背景下，受到凋亡細胞刺激后，這些多反應B細胞可擴增，經歷類型轉換重排后分泌IgG。類似凋亡細胞刺激導致的自然抗體和自身反應性抗體的擴增已在動物實驗中得到證實[6]。

C4d沉積是AMR的標志。目前普遍接受的觀點是移植腎病理中發現的C4d沉積源于DSA與供體內皮細胞表達的HLA抗原相結合。我們的體外研究顯示，多反應性的單克隆抗體及從AMR患者血清中純化的多反應性IgG可以激活補體途徑，C4d沉積于靶細胞表面，我們也觀察到AMR患者移植腎組織中C4d與活化的caspase-3的共區域化現象，而這些移植腎組織中均可將檢測到凋亡細胞。綜合以上發現，說明AMR患者中，除了DSA以外，血清中的多反應性抗體也可導致C4d在移植物中的沉積。值得關注的是，Haidar等人[7]在腎移植患者中發現了紅細胞表面C4d沉積程度與ARM的相關性。既然紅細胞來源于器官移植受者，不會成為DSA的靶細胞，因此有理由假設多反應性抗體很可能在此過程中發揮了作用。值得重視的是，C4d在紅細胞表面的沉積也被發現并作為系統性紅斑狼瘡進展程度的標志[8-10]。然而需要進一步研究來明確這些具有補體激活能力的多反應性抗體是否有細胞毒性，畢竟并非所有的C4d沉積都與移植物損傷有關[11]。

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1007-4287(2017)07-1242-03

2016-07-20)