姜黃素調控自噬在抑制HPV陽性宮頸癌細胞的體外研究

范世珍，于波海，陳旭娜，莫 莉

(深圳市福田區中醫院，廣東 深圳518034)

姜黃素調控自噬在抑制HPV陽性宮頸癌細胞的體外研究

范世珍，于波海，陳旭娜，莫 莉

(深圳市福田區中醫院，廣東 深圳518034)

目的 研究姜黃素在體外應用于誘導HPV陽性宮頸癌細胞凋亡與自噬的影響。方法 采用MTT檢測法和流式細胞儀檢測姜黃素(10,20,30,40 μmol/L)對HPV陽性宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響；采用自噬抑制劑3-MA與姜黃素聯用，觀察自噬對姜黃素抑制HPV陽性宮頸癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的影響；分光光度法檢測SiHa細胞Caspase-3活性；應用ELISA檢測姜黃素和(或)自噬抑制劑3-MA對宮頸癌SiHa細胞內Bcl-2、Bax和Beclin-1表達的影響。結果 姜黃素對HPV陽性的宮頸癌SiHa細胞的生長具有抑制作用，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性；而姜黃素與3-MA聯用后，對HPV陽性宮頸癌SiHa細胞誘導凋亡的作用明顯下降；與對照組相比，姜黃素組細胞Caspase-3活性明顯提高(P<0.01)、Bax和Beclin-1的表達均明顯升高(P<0.01)，而Bcl-2的表達明顯降低(P<0.01)；與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用組細胞Caspase-3活性和Bax表達均明顯下降(P<0.01)，而Bcl-2的表達明顯增加(P<0.01)。結論 姜黃素能有效抑制HPV陽性宮頸癌SiHa細胞的增殖，可以提高細胞Caspase-3活性、促進促凋亡因子Bax的表達升高和抑制凋亡因子Bcl-2表達下調，同時促進自噬相關蛋白Beclin 1的表達上調，從而誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞發生凋亡和自噬性細胞死亡。

姜黃素；宮頸癌SiHa細胞；細胞凋亡；自噬

(ChinJLabDiagn,2017,21:1264)

宮頸癌(Cervical cancer)作為全球第三大癌癥類型，是導致癌癥死亡率的第四大原因[1]，超過85%的宮頸癌病例和死亡發生在發展中國家。 其發病率與人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續感染高度相關，特別是HPV 16和18型[2,3]。國外一項研究發現，有超過50%和13%的宮頸癌分別與HPV16和18相關[4]。姜黃素(Curcumin)是一種來自姜科姜黃屬植物姜黃根莖中的多酚類物質[5,6]。現代分子生物學研究發現姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等多種藥理作用[7-13]。本研究旨在探索姜黃素對HPV 陽性宮頸癌SiHa細胞的增殖抑制作用，并初步研究這種作用是否與其對細胞自噬的調控有關，以期為臨床上HPV陽性宮頸癌的治療提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

姜黃素(純度98%)、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。細胞培養胎牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC 凋亡試劑盒(碧云天)；Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(南京凱基公司)、Bcl-2和Bax ELISA試劑盒(上海酶聯生物)；Beclin1檢測試劑盒(上海艾睿生物科技有限公司)；酶標儀(美國 Bio-Rad 公司)；細胞恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；細胞超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；流式細胞儀(FC500，美國Beckman)。其余試劑均購自上海生物工程有限公司。

1.2 細胞培養與處理

人宮頸癌細胞系SiHa購自中科院上海細胞庫，用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培養基中，于37℃、5% CO2以及95%空氣的恒溫細胞培養箱中培養。細胞傳代10-20次后，實驗設正常對照組(姜黃素 0 μmol/L)、姜黃素(10、20、30、40 μmol/L)組、3-MA(2 μmol/L)組和姜黃素(30 μmol/L)+3-MA組，分別加入姜黃素和(或)(2 μmol/L)3-MA作用24,48,72 h，隨后收集細胞進行下一步研究。

1.3 MTT檢測SiHa細胞增殖

選取對數生長期SiHa細胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個，經姜黃素和(或)3-MA作用24,48,72 h后，棄培養上清，加入100 μl MTT溶液(將10 μl 10 μg/ml MTT用90 μl培養基稀釋)，繼續培養4 h，待形成藍紫色的結晶沉淀后傾去上清，加入100 μl DMSO溶液，振搖15 min，待甲瓚顆粒完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度。

1.4 SiHa細胞凋亡情況檢測

取對數生長期SiHa細胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個，6 h后細胞穩定時進行實驗，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細胞，48 h后按照 Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 分光光度法檢測SiHa細胞Caspase-3活性

取對數生長期SiHa細胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個，6 h后細胞穩定時進行實驗，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細胞，48 h后采用試劑盒所附操作指南通過酶標儀檢測SiHa細胞內Caspase-3活性。

1.6 姜黃素對宮頸癌SiHa細胞內Bcl-2、Bax和Beclin-1表達的影響

取對數生長期SiHa細胞接種于96孔板中，每孔接種量1.0×105個，6 h后細胞穩定時進行實驗，分別加入姜黃素和(或)3-MA處理細胞，48 h后分別按照試劑盒說明書對SiHa細胞內的Bcl-2、Bax和Beclin-1 進行檢測。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 姜黃素對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

由圖1可見，與對照組(0μmol/L)相比，不同濃度的姜黃素(10、20、30、40μmol/L)分別處理宮頸癌SiHa細胞24、48、72h后，宮頸癌SiHa細胞的生長均受到不同程度抑制，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性。當30μmol/L濃度的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞48h后，宮頸癌SiHa細胞增殖的抑制率為48.6%(P<0.01)，因此，后續實驗中選用30μmol/L濃度的姜黃素進行。

圖1 不同濃度姜黃素在不同時間點對宮頸癌SiHa細胞增殖的抑制率

2.2 姜黃素與自噬抑制劑3-MA聯用對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

由圖2可見，與對照組相比，30μmol/L濃度的姜黃素作用于宮頸癌SiHa細胞48h后，宮頸癌SiHa細胞的生長均受到明顯抑制(P<0.01)；而單獨使用自噬抑制劑3-MA(2μmol/L)處理細胞48h，對宮頸癌SiHa細胞的生長無明顯影響(P>0.05) 。與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用組對宮頸癌SiHa細胞增殖的抑制作用明顯下降(P<0.01)。MTT結果提示，姜黃素對宮頸癌SiHa細胞增殖具有明顯抑制作用，而自噬抑制劑3-MA可以降低姜黃素抑制宮頸癌SiHa細胞增殖的作用。

注：與對照組比較*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.3 姜黃素與自噬抑制劑3-MA聯用對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

由圖3細胞凋亡檢測結果可見，與對照組相比，30μmol/L濃度的姜黃素組中細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；而自噬抑制劑3-MA組中細胞的凋亡率無明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用組中宮頸癌SiHa細胞的凋亡率明顯下降(P<0.01)。上述結果與MTT檢測細胞活力結果相一致。

注：與對照組比較，*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.4 姜黃素對宮頸癌SiHa細胞Caspase-3活性的影響

如圖4所示，與對照組相比，姜黃素處理可以提高宮頸癌SiHa細胞Caspase-3活性，并呈濃度依賴性(P<0.01)；而3-MA組細胞Caspase-3活性無明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用組中細胞Caspase-3活性明顯下降(P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.01；與姜黃素組比較，#P<0.01。

2.5 姜黃素對宮頸癌SiHa細胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達的影響

與對照組相比，姜黃素組細胞中Bax和Beclin-1表達明顯增加(P<0.01)，而Bcl-2的表達明顯減低(P<0.01)；而3-MA組細胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達無明顯變化(P>0.05 ) 。與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用組細胞Bax表達均明顯下降(P<0.01)，而Bcl-2的表達增加(P<0.01)，詳見表1。

表1 姜黃素對宮頸癌SiHa細胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.01；與姜黃素30 μmol/L組比較，#P<0.01。

3 討論

姜黃素是一種來源于姜黃根莖(姜黃)中的多酚類物質，也是亞洲和印度最喜歡的食品調味品之一[6]。以往的實驗和臨床研究發現，姜黃素具有多種生物和藥理作用，包括抗炎[8，9]，抗氧化劑[10]，保肝[11]，抗關節炎[12]，抗癌和化學預防[13]和免疫調節[7]等。本實驗研究應用姜黃素(10、20、30、40 μmol/L)分別處理宮頸癌SiHa細胞24、48、72 h后，發現姜黃素對HPV陽性的宮頸癌SiHa細胞的生長具有抑制作用，而且這種抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性。這與之前的文獻報道相似[3,6,7]，然而姜黃素抑制HPV陽性宮頸癌SiHa細胞增殖的具體機制至今尚不完全清楚。

自噬是一種非凋亡性細胞死亡，通過溶酶體的作用降解不必要或功能失調的細胞成分，特別是當細胞面臨諸如放射和化學治療等惡劣環境時，自噬對細胞的生存必不可少。在自噬過程中，靶向的細胞質成分被裝入雙膜囊泡(自噬體)，其與溶酶體融合以產生自溶質并因此降解。研究發現自噬在調節細胞代謝平衡、抗腫瘤以及抵抗微生物等方面起著重要的生物學作用[14]。自噬是細胞防御和應激調控的重要機制。自噬在病毒感染和機體免疫中起調控作用，自噬過程異常可以導致細胞死亡。許多RNA病毒和DNA病毒感染的細胞都存在自噬現象。自噬在宿主免疫防御中起重要作用，包括細胞生長與死亡，腫瘤抑制和轉移，抗原呈遞，病原體清除，抗衰老和神經變性等[14,15]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是目前常用的一種自噬抑制劑，主要通過抑制哺乳動物細胞中的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)來抑制自噬的起始階段。本實驗發現姜黃素可以誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞凋亡，而姜黃素分別與3-MA聯用后，對HPV陽性宮頸癌SiHa細胞誘導凋亡的作用明顯下降。說明姜黃素誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞凋亡的作用可能與誘導細胞自噬有關。

Beclin 1 是哺乳動物的自噬相關蛋白，與自噬的激活和自噬體的形成密切相關[16]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因， 而活化的Caspase 3 常被用作細胞凋亡的標記物，它們在腫瘤細胞凋亡中具有重要作用[17]。自噬與凋亡不單參與維持機體正常生理功能的平衡，還參與腫瘤的發生和發展過程，在特定條件下，凋亡與自噬之間存在著互相促進、互相拮抗又或是互相轉換的復雜關系[18]。本實驗發現姜黃素可以通過提高HPV陽性宮頸癌SiHa細胞Caspase-3活性，誘導細胞Bax的表達升高和Bcl-2的表達降低而發揮誘導細胞凋亡的作用。此外，我們還發現姜黃素在調控細胞中凋亡相關蛋白表達的同時，還引起細胞Beclin 1的表達升高；而與單獨應用姜黃素組相比，姜黃素與3-MA聯用后，宮頸癌SiHa細胞Beclin 1的表達均明顯下降，同時聯用3-MA組細胞Caspase-3活性和Bax的表達也明顯下降，而Bcl-2的表達升高，姜黃素誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡的作用受到明顯抑制。提示姜黃素可以通過提高細胞Caspase-3活性、上調Bax表達和抑制Bcl- 2表達，同時上調自噬相關蛋白Beclin 1表達，誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞凋亡。

綜上所述，本實驗研究發現姜黃素能有效抑制HPV陽性宮頸癌SiHa細胞的增殖，可以提高細胞Caspase-3活性、促進促凋亡因子Bax的表達升高和抑制凋亡因子Bcl-2表達下調，同時促進自噬相關蛋白Beclin 1的表達上調，從而誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞發生凋亡和自噬性細胞死亡。在隨后的實驗中，我們將對姜黃素誘導HPV陽性宮頸癌SiHa細胞發生自噬的機制及其與凋亡的關系開展進一步研究，以進一步明確自噬在姜黃素抑制HPV陽性宮頸癌細胞增殖中的分子機制。

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Curcumin regulated mitochondrial autophagy in the inhibition of HPV-positive cervical cancer cells

FANShi-zhen,YUBo-hai,CHENXu-na,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TraditionalChineseMedicalHospitalofFutian,Shengzhen,Guangdong518034,China)

Objective To study the effect of curcumin on the apoptosis and autophagy of HPV-positive cervical cancer cells in vitro.Methods The effects of curcumin (10,20,30,40 μmol / L) on the proliferation and apoptosis of HPV-positive cervical cancer SiHa cells were detected by MTT assay and flow cytometry; autophagy inhibitor 3-MA

was used in combination with curcumin to observe the effect of autophagy on curcumin inhibition of HPV positive cervical cancer cell proliferation and induction of apoptosis; the expression of Caspase-3 in SiHa cells was detected by spectrophotometry,and the effects of curcumin and / or autophagy inhibitors (3-MA) on the expression of Bcl-2 and Bax in cervical cancer SiHa cells were detected by ELISA.Results Curcumin inhibited the growth of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,and the inhibitory effect was in a dose-dependent and time-dependent manner.After curcumin combined with 3-MA,the effect of curcumin on the HPV-positive cervical cancer SiHa The effect of cell apoptosis was significantly decreased.Compared with the control group,the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 in the curcumin group was significantly higher than that in the control group (P<0.01),while the expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.01) (P<0.01),and the expression of Bcl-2 was significantly higher in the combination of curcumin and 3-MA group (P<0.01),and the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 increased (P<0.01).Conclusion Curcumin can effectively inhibit the proliferation of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,can promote the expression of pro-apoptotic factors Bax,Caspase-3 and inhibit the down-regulation of apoptosis factor Bcl-2 expression,while promoting the expression of autophagy-related protein Beclin 1 Upregulation,which induced HPV-positive cervical cancer SiHa cells apoptosis and autophagic cell death.

Curcumin;Cervical cancer SiHa cells;Apoptosis;Autophagy

2015年深圳市科技研發資金基礎研究資助項目 (JCYJ20150331091010278)

1007-4287(2017)07-1264-05

R737.33

A

范世珍，女，44歲，主任技師，學士學位，從事臨床檢驗研究。

2016-12-26)