皮質酮促進大鼠成骨細胞內脂質積聚的量效與時效作用的觀察

鄭錦暢 康銀輝 魏波 祝兆波 王朝軍 林顥 李廣盛 郭偉雄 荊凱鵬 孫欣 彭智恒

廣東醫科大學附屬醫院骨科中心，廣東 湛江 524001

糖皮質激素(Glucocorticoids, GCs)被廣泛用來治療過敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但長時間應用會不同程度的引起骨量丟失，甚至會發生骨壞死[1,2]。這可能與激素抑制成骨細胞的分化、增殖，促進成骨細胞、骨細胞的凋亡等相關[3]。有研究發現激素作用后的股骨頭內骨細胞胞質中有大量的脂質沉積[4,8]。是何種原因導致該現象發生，目前尚無明確解釋，為闡明這一現象本文擬用皮質酮以不同濃度、時間作用于成骨細胞，觀察細胞中脂質沉積現象及脂質合成相關基因與下游酶的表達特點，從而分析可能機制的所在。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：新生24 h內SD胎鼠，購于廣西醫科大學動物實驗中心。

1.1.2主要藥物及試劑：皮質酮(日本梯希愛)；反轉錄試劑盒，SYBR?Green qPCR熒光染料(大連寶生物公司)；SDS(Sigma公司)；Tweenn20(BIOSHARP公司)；蛋白Marker(Thermo Science)；SREBP1一抗兔抗鼠，SREBP2一抗兔抗鼠，HMGCR一抗兔抗鼠，FAS一抗兔抗鼠(SANTA CRUZ公司)；HRP標記的驢抗山羊二抗，蛋白酶抑制劑(上海碧云天公司)；蛋白酶裂解液(上海貝博公司)；化學發光試劑盒(天根公司)；HRP標記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)； Nile Red(上海源葉科技公司)；茜素紅S(上海華東試劑公司)。

1.1.3主要儀器設備：LightCycler480熒光定量PCR儀[羅氏(上海)有限公司]；激光共聚焦顯微鏡[羅氏(上海)有限公司]；CO2培養箱(Thermo賽默飛世爾科技公司)；OLYMPUS光學倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(BIO-RAD)。

1.2 實驗方法

1.2.1皮質酮溶液配制：將34.6 mg皮質酮粉劑溶入10 mL的DMSO(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)中，充分混勻，配成10 μmol/mL的貯存液，存放于4 ℃，使用前用培養基逐級稀釋成100、10、1、0.1、0.01 μmol/L的溶液進行實驗。

1.2.2成骨細胞的分離：提取SD胎鼠(出生24 h內)成骨細胞，無菌取下胎鼠顱骨，放入無菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質，然后用剪刀將顱骨頭剪成1×1 mm3大小的組織塊，移至15 mL離心管中，加入5mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型膠原酶的消化液消化，消化6個循環，每次在37 ℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的細胞懸液，1 300 r/min離心10 min，棄上清，沉淀的細胞用不含血清的高糖DMEM洗劑離心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸吹打均勻后，以1×105/mL接種于培養瓶中，放入5%CO2,、37 ℃的培養箱中培養，24 h換液, 以后每2～3 d換液并在顯微鏡下觀察細胞生長情況， 待細胞長至半匯合鋪滿瓶底時， 用0. 25%胰蛋白酶進行消化、 傳代。

1.2.3成骨細胞的鑒定：①成骨細胞形態觀察：每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長。②將傳到第三代的細胞以2×105個/mL接種到鋪有蓋玻片的六孔板中進行細胞爬片，3～4 d后將蓋玻片撈出進行細胞內堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下觀察。③茜素紅染色：稱取0.1 g茜素紅粉劑溶于100 mL蒸餾水中配成0.1%的茜素紅溶液，將細胞爬片10～14 d后的蓋玻片撈出，用PBS輕輕沖洗兩遍，用0.1%的茜素紅溶液染色30 min后蒸餾水沖洗兩遍，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4成骨細胞增殖能力分析：將傳到第三代的細胞以5×104/mL密度接種于96孔板，在37 ℃，95%O2，5%CO2細胞培養箱中培養6 h，使細胞完全貼壁。以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的皮質醇作用24、48、72 h后，以CCK-8法測定細胞存活率。

1.2.5實驗分組：實驗隨機分為A、B、C、D組(皮質酮作用濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L)，每組作用24、48、72 h三個時間段，作用后各組細胞Nile Red脂質染色，實時熒光定量PCR法測定各組細胞SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS的mRNA表達, Western blot測SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白表達。

(1)Nile Red染色：將A、B、C、D組爬片成骨細胞用PBS沖洗兩遍，每個蓋玻片避光滴一滴0.1%Nile Red的溶液于37 ℃的水浴箱中染色10 min，10 min后取出玻片PBS沖洗，開啟激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察。

(2)mRNA檢測： 以 105/孔的密度將細胞接于 6孔板中, 加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，再加入皮質酮作用濃度分別為0、0.1、1、10 μmol/L培養液, 培養24，48，72 h后提取總RNA，經過濃度測定、逆轉錄反應后行實時熒光定量PCR反應。SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS和內參β-actin引物序列見表1。反應條件為首先95 ℃變性30 s；然后按95 ℃ 5s，60 ℃ 20 s擴增40個循環。每個組的標本重復3次。在反應的第二階段，在每個循環結束后采集熒光信號強度，60～95 ℃間進行融解曲線分析，以分析反應中引物的特異性。測得的Ct值來計算每個樣本目的基因的相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR.

注：F: Forward Sequence R: Reverse Sequence

(3)蛋白表達檢測：采用Western blot法。提取各組細胞總蛋白，蛋白質定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度，與5×緩沖液混合，100 ℃變性5 min。各種一抗以1∶1000稀釋，內參(β-actin)按1∶2000稀釋，二抗按1∶5000的比例稀釋。

1.3 統計學處理

本實驗數據用SPSS 17.0統計軟件進行分析，所有數據均先進行正態性與方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，擬P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞分離與鑒定

成骨細胞倒置顯微鏡觀察：原代細胞培養1 d后貼壁，細胞呈梭形、多角形，7～10 d單層鋪滿瓶壁。傳代細胞多為梭形。(圖1 A、B)

堿性磷酸酶(ALP)染色：取第三代細胞做堿性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黃色為陽性(圖1 C)。

茜素紅(鈣化結節染色)染色：細胞匯合時均呈多層重疊生長，細胞局部堆集成灶狀，形成鈣結節，染色后鈣結節呈橘紅色(圖1 D)。

2.2 不同濃度皮質醇對成骨細胞增殖的影響

CCK-8示：高濃度皮質酮對細胞增值有抑制作用，隨著濃度增加，對細胞增值抑制明顯增加，地塞米松濃度在0.01 μmol/L～100 μmol/L均可抑制細胞增殖，并呈濃度依賴性。

2.3 不同濃度皮質酮作用后成骨細胞內脂質及相關基因、蛋白表達的變化

2.3.1Nile Red染色：Nile Red染色提示，皮質酮作用成骨細胞后，成骨細胞內的脂質染色隨皮質酮濃度增高染色增強；同一皮質酮濃度在作用24、48、72 h時成骨細胞內脂質染色無明顯差異。

圖2 A：皮質醇作用24 h后成骨細胞的存活率；B：皮質醇作用48 h后成骨細胞的存活率；C：皮質醇作用72 h后成骨細胞的存活率(與對照組比較，*P<0.05)Fig.2 A: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 24 h; B: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 48 h; C: The survival rate of osteoblasts conditioned with cortisol after 72 h. (*Compared with the control group, P<0.05)

圖3 激素對成骨細胞作用24、48、72 h后 Nile Red染色結果紅色熒光表示脂質在細胞內的沉積A: 0 B: 0.1 C: 1 D: 10 (μmol/L)Fig.3 The Nile red staining results of osteoblasts conditioned with the hormone after 24 h, 48 h, and 72 h Red fluorescent lipid deposition in a cellA: 0; B: 0.1; C: 1; D: 10 (μmol/L).

2.3.2應用皮質酮后熒光定量PCR測定成骨細胞脂質調節基因與酶表達：從測定的結果可以看出當不同的濃度的激素分別作用24 h后，細胞內SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表達量升高(P<0.05)，但當作用的時間延長到48、72 h后，脂質合成的SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS酶的基因表達量呈下降趨勢(P<0.05)(圖 4)。

2.3.3蛋白免疫印跡檢測成骨細胞內SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表達量：皮質醇1μmol/L作用24 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表達升高；皮質醇1μmol/L作用48 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未見明顯差異；皮質醇1μmol/L作用72 h后與對照組相比，SREBP1、FAS表達降低，SREBP2表達升高，HMGCR未見明顯差異(圖5)。

3 討論

激素性股骨頭壞死是糖皮質激素(glucocorticoids, GCs)應用的嚴重并發癥。目前研究表明有關激素性股骨頭壞死的發病機制主要有：一是激素對成骨細胞、骨細胞、破骨細胞的直接作用，抑制成骨細胞的分化、增殖，促進成骨細胞、骨細胞的凋亡，延長破骨細胞的生存期，最終導致骨量丟失，股骨頭塌陷；二是激素的間接作用，通過促進血管內皮細胞的凋亡導致血栓形成，抑制血管內皮生長因子表達使血管修復及新生血管形成障礙，影響血管收縮和舒張活性物質的表達及脂質代謝，抑制性激素的分泌，減少小腸對鈣離子的吸收及促進尿中鈣離子的流失等[5]。但就激素如何發揮作用，其具體的分子作用機制還有待進一步研究。

近來有關的研究表明，糖皮質激素可以通過脂肪細胞來間接的影響成骨細胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓內骨髓間充值干細胞轉錄因子Cbfa1/Runx2表達，促使特異性轉錄因子PPARγ的表達，從而促使骨髓間從質干細胞向脂肪細胞分化，抑制其向成骨細胞的分化，導致脂肪細胞數量/成骨細胞數量比例增加[6,7]。

Kawai等[4]發現在應用大劑量甲強龍治療兔子4周后，首先出現高脂血癥和脂肪肝，電子顯微鏡觀察后可發現股骨頭部位的骨細胞內出現逐漸增大的脂滴，細胞核被擠壓到無脂滴的一側，最終出現細胞裂解，但是他們未能證明激素性股骨頭壞死與骨細胞內脂質沉積的相關性。Maruno等[8]同樣發現激素作用后出現骨細胞內脂質沉積，在同時應用克利貝特(一種新型的纖維酸類降脂新藥)后骨細胞內的脂質沉積降低。

圖4 不同濃度的皮質酮對成骨細胞作用24、48、72 h后對細胞內SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS基因表達的影響(與對照組比較，*P<0.05)Fig.4 The effects of different concentrations of corticosterone on the osteoblasts of the gene expression in SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS after 24 h, 48 h and 72 h

圖5 蛋白免疫印跡檢測成骨細胞內SREBP1、SREBP2、HMGCR、FAS蛋白的表達量Fig.5 The expressions of SREBP1, SREBP2, HMGCR and FAS protein in osteoblasts detected by Western blot

就成骨細胞而言，應用糖皮質激素后骨細胞內可出現大量脂質沉積[4,8]，這是否也是激素性骨損害原因之一，目前未見明確解釋，那么激素影響下成骨細胞內出現脂質的原因到底是如何？因此本研究觀察了成骨細胞在激素影響后，脂質合成相關的基因與關鍵酶的表達，初步探討這一現象。

SREBP是一種轉錄調節因子，分為SREBP1和SREBP2兩型，其中SREBP1主要調節細胞內脂肪酸和甘油三酯的含量，SREBP2主要調節細胞內膽固醇的含量。FAS由一條多肽鏈構成的多功能酶，通常以二聚體形式存在，在體內主要催化脂肪酸的合成， HMGCR在體內主要促進膽固醇的合成。當細胞內脂肪酸、甘油三酯及膽固醇的含量降低時，SREBP1、SREBP2的基因轉錄會上升，進而促進相應的FAS、HMGCR的表達，使細胞內脂肪酸、膽固醇的含量增多，相反，當細胞內脂質含量增高時，會抑制SREBP1、SREBP2的表達，進而減少胞內脂質的合成[9,10]。盛輝等[11]指出在激素性骨壞死發生過程中，早期血管外脂肪堆積表現為大量生成的小脂肪細胞，后期血管外脂肪堆積表現為脂肪細胞出現肥大。

本文應用多次酶消化法獲得大鼠成骨細胞，鑒定后用于實驗。不同濃度皮質酮作用成骨細胞后可見細胞內Nile Red脂質染色隨皮質酮濃度增高染色增強，而相同濃度皮質酮在作用成骨細胞24、48、72 h時細胞內脂質染色無明顯差異，提示皮質酮可以促使成骨細胞內脂質的增加，造成脂質的細胞內過度積聚，這種作用與皮質酮濃度相關。

本文通過對細胞內脂肪酸、膽固醇合成的相關的限速酶基因表達觀察發現當皮質酮濃度0.1、1、10μmol/L作用24 h后，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達升高，但作用時間延長到48、72 h，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達量降低，這可能是由于激素通過24 h的作用，使成骨細胞內脂質沉積到一定的量后反饋抑制了細胞內脂質合成相關酶的基因表達，使脂質合成相關的酶的基因表達量下降。

通過熒光定量PCR可以發現在作用24 h后，不同濃度皮質酮均可促進SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的基因表達升高，本研究選取皮質酮濃度為1μmol/L做蛋白免疫印跡實驗，成骨細胞在皮質酮作用 24 h后，與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR的表達升高；皮質醇1μmol/L作用48 h后與對照組相比，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR未見明顯差異；皮質醇1μmol/L作用72 h后與對照組相比，SREBP1、FAS表達降低，SREBP2表達升高，HMGCR未見明顯差異，這可能是由于激素作用成骨細胞24 h后細胞內的脂質合成的增多，出現SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表達的升高；但是在24～48 h的某個時間，細胞內的脂質蓄積到一定程度，開始反饋抑制成骨細胞內脂質合成，SREBP1、SREBP2、FAS、HMGCR表達開始下降，與對照組相比差異不明顯；而在作用的72 h出現了SREBP1、FAS表達降低，SREBP2表達升高，HMGCR未見明顯差異，這可能是由于激素對成骨細胞內脂肪酸、甘油三酯、膽固醇合成作用的不同引起。

文獻[12-14]表明生理劑量的激素(≤10-8mol/L)可以促進成骨細胞的分化，然而超生理劑量的激素降低成骨細胞的活性，抑制成骨細胞的分化。本研究采用的激素濃度為0.1、1、10μmol/L，為超生理劑量濃度，均能促進成骨細胞內脂質異常蓄積。

因此，通過目前研究可以得出超生理劑量糖皮質激素可能通過促進脂質合成過程中相關酶基因及蛋白表達來促進成骨細胞內脂質的沉積，這種作用與激素的濃度明顯相關。但激素是否通過促進其胞內脂質沉積來對成骨細胞產生負面作用，或者能否通過抑制激素作用的成骨細胞內脂質合成中的某一條通路，從而達到預防激素性股骨頭壞死的目的，還有待進一步探討。