卵巢切除大鼠在不同時期RANKL、OPG蛋白表達的變化及與BTMs的相關性

林海鳴 黃云梅 吳銀生 黃美雅 陳翔 劉振濤 林燕萍

福建中醫藥大學，福建 福州 350122

絕經后骨質疏松(PMOP)發病的主要原因是由于絕經后婦女卵巢功能下降，特別是雌激素的缺乏，導致骨吸收作用增強，造成快速骨丟失所引起。PMOP的發生與骨代謝失衡密切相關，目前研究表明OPG/RANKL/RANK軸是影響骨代謝的重要途徑，許多研究工作基于該軸從骨代謝入手對PMOP的發生機制進行探討，但目前對OPG/RANKL/RANK軸與骨代謝關系的研究尚未完全闡明[1]，有待更深入的研究。課題組在既往工作中已對去卵巢大鼠骨代謝標志物的變化進行了實驗研究[2]，并基于OPG/RANK/RANKL軸做了對成骨細胞OPG、RANKLmRNA表達的探討[3]。由于PMOP是一進展性疾病，有必要在實驗中進行動態觀測，目前基于該軸動態檢測相關蛋白表達與骨代謝指標關系的研究較少見報道，因此本研究擬對不同時期RANKL、OPG蛋白表達的變化及與BTMs(骨轉換標志物)的相關性做一初步的探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：3月齡雌性SD大鼠48只，SPF級，體重(267±21)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號：2015000517533。在福建中醫藥大學動物實驗中心鼠類實驗室飼養，醫學實驗動物環境設施為SPF級(合格證號：SYXK (閩)2014-0005)。

1.1.2主要試劑：兔抗大鼠RANKL一抗(武漢博士德公司)，兔抗大鼠OPG一抗(SAB公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠、兔IgG(Earthox LLC公司)，一、二抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)，ECL發光試劑(Thermo Scientific公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(碧云天生物技術研究所)，RIPA裂解液(南京諾唯贊公司)，BGP、CTX-I、BALP和TRAP-5b Elisa試劑盒(上海西唐公司)，PVDF膜(Invitrogen公司)。

1.1.3主要儀器設備：AIR TECH無菌操作臺(蘇凈集團安泰公司)，64R低溫高速離心機(美國Beckman公司)，MILLI-Q超純水裝置(美國Milipore公司)，Du650紫外分光光度計(美國Beckman公司)，Trans-Blot Turbo蛋白轉印系統(美國BIO-RAD公司)，ChemiDocXRS+化學發光成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理：48只3月齡SD雌性大鼠隨機分成Sham組和OVX組，每組各24只。OVX組行雙側卵巢切除術：用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg進行腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，沿子宮雙側探及左、右卵巢，卵巢結扎切除術后腹壁逐層縫合。術后3 d連續肌注青霉素預防感染(8萬單位/只)；Sham組未切除卵巢，其余步驟與OVX組同。

1.2.2取材：于術后第2、6、10、14周分批進行取材，每批次每組各取6只。大鼠以10%水合氯醛麻醉后，經腹主動脈采血，全血室溫靜置2 h后，經3 000 r/min離心20 min，取血清，1.5mLEP管分裝，-80 ℃凍存，用于血清相關指標檢測。取大鼠腰椎，其中L5、L6置于1.5mLEP管，-80 ℃凍存，用于骨組織OPG、RANKL蛋白檢測。骨組織取材時，均在取材中及時放入液氮中暫存。

1.2.3指標檢測：Western blot檢測各時期大鼠骨組織的OPG、RANKL蛋白表達：取大鼠L5、L6提取骨組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳后切膠，然后將膠上蛋白轉印至PVDF膜，經封閉后一抗孵育過夜。次日孵二抗后，加ECL化學發光試劑，在化學發光成像系統上顯影。Image Lab圖象分析軟件分析目的條帶，讀取并記錄每條帶的光密度值。Elisa檢測各時期大鼠血清骨轉換標志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b的變化。分別按相應Elisa試劑盒說明進行檢測，最后酶標儀讀取OD值，并計算各標志物水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 OPG、RNAKL蛋白表達

Western blot檢測不同時期大鼠L5、L6骨組織的OPG、RNAKL蛋白表達，與Sham組比較，OVX組在術后各時期骨組織RANKL蛋白表達均升高，第2周(P<0.01)和第10、14周(P<0.05)有統計學意義，OPG蛋白表達在第2周(P<0.01)和第6周(P<0.05)顯著降低。見圖1、2。

圖1 大鼠骨組織RANKL、OPG的Western Blot結果Fig.1 Western Blot results of RANKL and OPG in rat bone tissue

圖2 大鼠骨組織RANKL、OPG蛋白表達相對量結果比較注：與Sham組比較，* P<0.05，** P<0.01Fig.2 Comparison of the relative expression of RANKL and OPG in rat bone tissueNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 血清骨轉換標志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平

Elisa檢測不同時期大鼠血清骨轉換標志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b水平，與Sham組比較，術后第2周OVX組TRAP-5b水平顯著升高(P<0.01)，BGP、BALP、CTX-I水平顯著升高(P<0.05)；術后第6周OVX組BGP、BALP水平顯著升高(P<0.01)，CTX-I水平顯著下降(P<0.05)、TRAP-5b水平顯著下降(P<0.01)；術后第10周及第14周OVX組CTX-I水平顯著升高(P<0.05)，BALP水平顯著升高(P<0.01)。見圖3。

2.3 骨組織OPG、RANKL蛋白表達與骨轉換標志物的相關性

BTMs數據不符合正態分布，采用Spearman檢驗，相關性分析顯示骨組織RANKL與血清CTX-I、TRAP-5b水平成正相關(P<0.05)，骨組織OPG與血清CTX-I、TRAP-5b水平成負相關(P<0.01)。見表1。

3 討論

骨代謝標志物可分為一般生化標志物、骨代謝調控激素和骨轉換標志物3類，PMOP是高轉換型骨質疏松癥，本實驗選擇骨轉換標志物(BTMs)為檢測指標，包括骨形成標志物BGP、BALP，骨吸收標志物CTX-I、TRAP-5b。

表1 骨組織RANKL、OPG與血清骨轉換標志物的相關性分析Table 1 Correlation analysis between serum BTMs and RANKL and OPG of bone tissue

注：*在0.05水平(雙側)上顯著相關，**在0.01水平(雙側)上顯著相關。
Note:*Significant correlation at 0.05 level(bilateral),**Significant correlation at 0.01 level(bilateral).

圖3 不同時期大鼠血清骨轉換標志物(BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b)變化的比較注：與Sham組比較，* P<0.05，** P<0.01Fig.3 Comparison of BTMs (BGP, BALP, CTX-I and TRAP-5b) in serum of rats at different periodsNote:Compared with Sham group,*P<0.05,**P<0.01

TRAP-5b是由破骨細胞產生的非膠原蛋白，是早期反映破骨細胞活性的標志物[4]，血清TRAP-5b與骨吸收水平呈正相關；CTX-I是I型膠原的降解產物，是反映骨吸收的特異性指標。本實驗顯示OVX組術后2周TRAP-5b顯著升高，提示卵巢切除后骨吸收增強，但該指標在后期(10、14周)無顯著性差異，而CTX-I在第2、10、14周OVX組均較Sham組顯著升高，持續時間較長，可能與骨組織的構成有關，骨有機成分主要是由I型膠原組成，當骨吸收增強時I型膠原降解較正常增多，降解產物增加，CTX-I升高，且CTX-I有骨I型膠原分子間交聯物的重要區段和近似交聯物的殘基，其緊密結構可以保護不受肝、腎的進一步降解，具有較好的穩定性[5]，因此在術后第10、14周組間仍有顯著性差異。實驗中TRAP-5b的早期升高及CTX-I術后第2、10、14周的升高均提示，卵巢切除后由于雌激素水平下降，導致骨吸收增加，但在第6周TRAP-5b、CTX-I有階段性的下降，結合骨形成標志物BALP及BGP的結果(第6周BALP、BGP水平OVX組較Sham組高)，提示可能是快速骨丟失后的暫時的某種機制的骨吸收抑制。

BALP由成骨細胞分泌，在骨礦化過程中，將單磷酸酯水解成無機磷，增加局部無機磷的濃度，水解焦磷酸鹽，解除其對骨鹽形成的抑制作用，是成骨細胞成熟和具有活性的標志，是骨形成的特異及敏感標志物[5]；BGP是成骨細胞功能和骨質礦化的特殊標志物，由成骨細胞合成類骨質時釋放到細胞外基質，其中一小部分進入血液循環，因此血清中BGP水平變化，是直接反映骨形成的一種特異性指標，當骨基質降解時其中的BGP也進入血液循環中，因此BGP除了能反映成骨細胞的活性，在更大程度上反映的是骨轉換[6]。本實驗BALP檢測結果穩定，各時期水平總體呈升高趨勢，各時期OVX組均較Sham組顯著升高，提示卵巢切除大鼠繼發的骨形成增強。BGP水平在各時期OVX組均較Sham組升高，在第2、6周有顯著性差異，同樣提示卵巢切除大鼠的骨代謝活躍，骨轉換性提高。

以上顯示，卵巢切除大鼠骨轉換標志物隨時間推移呈動態變化，骨吸收標志物TRAP-5b在卵巢切除早期即有顯著的升高，而CTX-I總體升高、有階段性下降，升高持續時間更長，總體表現為以骨吸收增強為主的高轉換性骨代謝的特點。變化有顯著性差異的骨轉換標志物隨術后時間的延長呈下降趨勢，在第2、6周各標志物均有顯著性差異，到第14周僅BALP、CTX-I差異有統計學意義，可能是機體對早期快速骨吸收的一定程度的代償機制的作用。

OPG/RANKL/RANK系統是雌激素調節破骨細胞生成和抗骨吸收作用的重要途徑之一[7]，雌激素可抑制破骨細胞的分化、成熟及活性，從而抑制骨吸收，雌激素缺乏可促進OC形成、分化及增強其活性，這一過程與OPG、RANKL關系密切，實驗中OVX組骨組織RANKL表達較Sham組在第2、6周均升高，第2周有顯著性差異，而OPG表達顯著下降，導致同時期OVX組的RANKL/OPG比值顯著升高，顯示由于雌激素水平下降導致成骨細胞過度表達RANKL而降低OPG的表達，使RANKL與RANK結合，啟動OC的分化和功能活性，骨吸收過度活躍，切除卵巢早期過度表達RANKL而降低OPG表達的結果與之前一些學者的研究結果一致[8]。相應的骨轉換標志物TRAP-5b、CTX-I在第2周升高，進入骨量快速丟失階段，文獻資料也顯示大鼠在去卵巢后3周和6周，骨量下降較顯著，12周之后骨量持續平穩下降[9]。但在第6周OVX組TRAP-5b、CTX-I出現階段性下降，可能是機體的某種負反饋機制抑制骨吸收。有研究發現RANKL誘導表達的LGR4可做為負反饋信號抑制破骨細胞的分化與功能[10]，實驗中OVX組RANKL早期的顯著高表達可能通過類似的機制暫時抑制OC活性，以應對機體由于雌激素缺乏引起的快速骨量丟失。在第10、14周OVX組RANKL仍高表達，同期CTX-I均顯著升高，提示骨吸收持續增強，而BALP水平的顯著上調，提示伴隨成骨細胞活性增強，骨形成增加，但由于骨吸收強于骨形成，而導致骨質疏松癥的發生。相關性分析顯示骨轉換標志物CTX-I、TRAP-5b與骨OPG成負相關，與骨RANKL成正相關。

本實驗取材受到實驗動物的限制，無法連續多次大量采血和提取骨組織標本，使動態觀察的連續性受到限制，有待加大樣本、改進實驗進一步研究。