唑來膦酸、聚乳酸-羥基乙酸聚合物、β-磷酸三鈣復合支架修復去勢大鼠股骨干骺端骨缺損的實驗研究

王希明 劉波 崔振紅 潘琦

濟南市的第四人民醫院， 骨科 250031

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是因多種原因引發的一組以骨量減少、骨脆性增加及骨微結構變化為基礎病理的代謝性骨病變疾病，病人臨床主要表現為腰背疼痛、身長縮短、駝背及骨折并發癥。隨著世界經濟的快速發展、人類生活水平及衛生事業水平巨大提高，人們的年齡也在不斷的提高，骨質疏松的發病率越來越高。據最新的調查統計數據顯示，我國60歲以上人群中OP的發病率高達 56%，已成為威脅老年人群生活質量的重要疾病因素[1]。骨質疏松癥或骨密度減低癥人群中骨缺損常常愈合不佳，往往需要更長的時間[2]。因此一種合適的骨生物材料的使用可以對增加骨缺損的愈合速度與愈合質量具有顯著的臨床意義。我們早期使用唑來膦酸(ZA)干預骨質疏松大鼠股骨干骺端骨缺損時可以增加骨缺損的愈合[3]，但是和正常的骨代謝下骨組織的愈合相比，尚有不足之處；單純的骨生物材料β-磷酸三鈣(β-TCP)也可以促進骨質疏松骨缺損的愈合[4]，鑒于此我們假設唑來膦酸和β-TCP聯合使用可以明顯加速骨質疏松骨缺損的愈合。本研究使用去卵巢的方法誘導大鼠骨質疏松，在骨質疏松模型的基礎上建立雙側股骨干骺端骨缺損，植入ZA、聚乳酸-羥基乙酸聚合物(PLGA)、β-TCP復合人工骨，用修復結果來驗證我們假設。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇3個月齡的健康成年雌性SD大鼠50只，體重為220～270 g (清潔級，上海斯萊克公司中心提供)。實驗開始前，正常飲食和飲水，光照和黑暗各12 h，溫度為(23±2) ℃，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 實驗設備及材料

雙能X線骨密度檢測儀(美國HOLOGIC公司)；顯微CT(Micro-CT,SCANCO Medical AG公司，瑞士)；冷凍干燥機(德國 CHIST-ALPHA1-4)；聚乳酸—羥基乙酸聚合物(PLGA)山東岱罡生物技術公司；β-磷酸三鈣(β-TCP) 山東岱罡生物技術公司；唑來膦酸鹽(生產廠家:國藥集團國瑞藥業有限公司；國藥準字:H20041955)；鈣黃綠素 (Sigma, 美國)，25%戊二醛，丙酮，乙醚。

1.3 實驗方法

1.3.1大鼠骨質疏松模型的建立：制作骨質疏松雌性大鼠模型，具體如下[5]：隨機選取 5 只為假手術組，切開背部皮膚暴露雙側卵巢，不予摘除直接縫合；其余45 只大鼠接受雙側卵巢摘除術。術后飼養12周。45只去卵巢大鼠中隨機選擇5只為模型組。這兩組的大鼠均處死檢測股骨的骨密度，達到骨質疏松診斷標準即認為造模成功。

1.3.2ZA、PLGA、β-TCP 復合材料的制備：使用電子天平稱量一定重量純化后的PLGA 粉末，將其加入相當于其本身質量 10倍的1,4二氧六環溶液之中，磁力攪拌充分混勻，能夠使PLGA粉末充分溶入到1,4二氧六環溶液之中，制成混合溶液，靜置12 h后。再使用電子天平稱量與 PLGA 粉末等重的β-TCP 粉末和相當于β-TCP 粉末質量8%的ZA粉末，加入到混合溶液中。使用自動攪拌機器將以上配比完成的混合溶液強烈攪拌，直至形成均勻的糊狀漿液，再次超聲混勻，封閉容器，靜置約4 h。取出置入冷凍干燥機里干燥72 h。干燥完成后將材料取出使用去離子水洗去NaCl，間隔 1 h換水，直至使用AgNO3檢測不到NaCl為止，再次置入冷凍干燥機中干燥 48 h，取出放入4 ℃冰箱中保存備用，至此制作成功ZA、PLGA、β-TCP復合材料[6]。按照上述方法制成ZA、PLGA復合材料。

1.3.3股骨干骺端骨缺損模型的建立及ZA、PLGA、β-TCP復合材料干預：將已經成功建立骨質疏松模型的40只雌性大鼠，隨機均分成對照組，ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組，所有大鼠在雙側股骨干骺端建立骨缺損。后腿備皮，碘伏消毒，股骨髁部外側切開皮膚及皮下組織，鈍性分離至肌層，分離肌肉并直達骨面，用手觸摸感知關節部位，確認股骨髁部外側，定位后采用骨鉆鉆頭鉆孔 (直徑3 mm，深度6 mm)制造圓形骨缺損[7]， ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組分別植入相應的骨材料。確認無活動出血點后分層縫合，關閉腹腔后碘伏消毒。術后肌注2萬U/kg慶大霉素，1次/d，持續3 d。所有大鼠在處死前第18天以及處死前第5天, 每日分別腹腔內注射15 mg/kg劑量的鈣黃綠素。本實驗所使用的藥物劑量參考以前發表的治療骨質疏松效果明顯的文獻中所使用劑量[8]。術后3個月采用斷頸法處死所有大鼠，獲取雙側股骨標本，對其進行Micro-CT檢查并對標本進行切片及HE染色。

1.4 Micro- CT檢測

所有存活的大鼠在術后3個月時處死，完整取下大鼠雙側股骨，剔除周圍軟組織，生理鹽水沖洗后，采用10%的多聚甲醛固定用于Micro-CT 檢測。將左側股骨置于掃描床上，掃描興趣區為掃描完成后，選擇圓形骨缺損區域為感興趣區(region of interest， ROI)，得到皮質骨與松質骨的三維圖像，并用Micro-CT內置軟件(CT An software)進行定量分析。獲得大鼠股骨遠端缺損區域感興趣區域骨微結構參數骨體積分數 (bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb．Th)、骨小粱數量(trabeculae number，Tb．N)、 骨小粱分離度(trabecular spacing， Tb．Sp)、連接密度(connective density, Conn.D.)。

1.5 組織學檢測

待所有股骨經過Micro-CT檢測后，所有標本用4%多聚甲醛固定， EDTA脫鈣液中浸泡，每3～4天換液1次，連續脫鈣4周，X線檢測是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色。不脫鈣骨組織包埋塊修整后置于硬組織切片機沿股骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及光鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0 全自動圖像分析儀對骨礦化沉積率(MAR)進行計算。

1.6 統計學處理

采用SPSS軟件(版本19.0，Chicago，IL)進行統計分析，Image-ProPlus 6.0(Media Cybernetics，美國)軟件對圖像進行定量分析。通過獨立t檢驗來對兩組實驗結果的進行比較，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 去卵巢術后3個月各組大鼠骨密度結果

手術后經過12周的喂養，假手術組與去卵巢模型組大鼠股骨的骨密度分別為0.205±0.010 g/cm2，0.188±0.006 g/cm2，兩組之間比較P<0.01，差異有統計學意義。說明成功制備大鼠骨質疏松模型。

2.2 Micro- CT 三維重建分析及骨微觀參數

我們通過Micro- CT對感興趣區域進行三維重建，重建的結果如圖1所示，通過內置軟件計算的骨微觀參數如表1所示。我們可以通過觀察圖1明顯地發現ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組缺損區域新生骨明顯多于對照組，而且新生骨組織聯系緊密，骨小梁更粗。12周時，我們明顯可以觀察到ZA、PLGA、β-TCP有著最多的新生骨及最小尚存在的骨缺損。骨微觀參數更加明顯的表明ZA、PLGA、β-TCP組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和最低Tb.Sp，而對照組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D。和ZA、PLGA組，β-TCP組比較，ZA、PLGA、β-TCP組骨微觀參數差異有明顯的統計學意義，這些表明使用ZA、PLGA、β-TCP復合材料以明顯增加骨質疏松大鼠骨缺損修復速度。

圖1 4組大鼠材料干預12周后左側股骨干骺端骨干骺端感興趣區域Micro-CT三維重建結果(A：未用藥組；B：β-TCP組；C：ZA、PLGA組；D：ZA、PLGA、β-TCP組)Fig.1 Twelve weeks after the implantation, the Micro-CT 3D reconstruction of bone in the left femoral metaphysis region of interest in each group(A: Control group; B: β-TCP group; C: ZA/PLGA group; D: ZA/PLGA/β-TCP group)

Parameter對照組β-TCP組ZA、PLGA組ZA、PLGA、β-TCP組Tb.N2.13±0.09 2.23±0.11?&2.39±0.11?#2.76±0.11?#&Tb.Th0.11±0.010.12±0.01?&0.14±0.011?#0.16±0.01?#&BV/TV0.19±0.010.23±0.01?&0.27±0.02?#0.35±0.01?#&Tb. Sp0.54±0.120.47±0.08?&0.42±0.04?#0.25±0.03?#&Conn. D40.21±8.2451.27±5.67?&61.34±6.34?#76.78±14.43?#&

注：與對照組組比較，*P<0.05；與β-TCP組比較，#P<0.05；與ZA/PLGA組比較，&P<0.05。

2.3 組織切片觀察結果

大鼠左側股骨缺損區域經過HE染色結果如圖2所示，我們可以清楚發現ZA、PLGA、β-TCP組股骨遠端缺損區骨小梁的量遠遠大于對照組組，且骨小梁之間聯系緊密，排列有規律，骨材料剩余更少；切片的觀察結果進一步證實Micro-CT的結果。熒光共聚焦顯微鏡的觀察的結果如圖3所示，通過Image-Pro Plus 6.0 計算言ZA、PLGA組，β-TCP組及ZA、PLGA、β-TCP組的結果分別為：0.91±0.10，1.07±0.11，1.28±0.16 和1.51±0.19，通過SPSS軟件統計表明各組之間差異有統計學意義(P<0.001)，這表明ZA、PLGA、β-TCP復合材料可以加速缺損區域新生骨組織的礦化。

3 討論

本次實驗中使用雌性SD大鼠經過去卵巢手術后，在正常環境下喂養12周通過檢測股骨骨密度的變化來驗證骨質疏松模型建立是否成功。隨后在去卵巢大鼠的雙側股骨干骺端建立標準化的骨缺損，分別植入ZA、PLGA，β-TCP及ZA、PLGA、β-TCP骨生物材料，通過骨缺損區域骨生物材料來影響局部骨代謝， 12周后處死大鼠取下雙側股骨行Micro-CT、組織學檢測，實驗的結果表明相對于單獨使用ZA、PLGA，β-TCP，ZA、PLGA、β-TCP復合材料的使用可以更好加速骨質疏松骨缺損的愈合。

絕經后骨質疏松主要由于雌激素的不足，因此，骨形成較快，但破骨更快，屬于高轉化型。老年型骨質疏松，骨量丟失較慢，屬于低轉化型[9]。但無論哪種骨質疏松癥，骨形成和骨吸收的平衡打破了，都將影響骨質最終導致一系列的病理性骨折如常見的骨質疏松骨折。骨質疏松性骨缺損愈合較普通創傷性骨缺損愈合時間延長，效果差，靠自身骨代謝修復會造成骨延遲愈合或不愈合，甚至影響患肢的功能，這類疾病往往需要植骨。骨質疏松骨缺損由于其特殊性，目前主要通過藥物或者局部的人工骨材料的植入來干預其修復進程。但是兩者都有不足之處，雖然單純的骨生物材料如β-TCP具有良好的生物相容性、容易生物降解吸收、具有骨傳導性以及無毒副作用，被視為優良的骨替代材料[10]。但是其誘導能力有限，特別是對骨質疏松骨缺損這類特異性的骨缺損時更加不適合，在β-TCP基礎上進行改變是一種非常合適的方法。

唑來膦酸因其具有強大的抗骨質吸收的作用而常用于骨質疏松的防治，最近的幾項研究表明唑來膦酸可以不同程度增加不同部位的骨密度，顯著降低髖部、椎體和非椎體骨折達到50%[11, 12]。唑來膦酸對骨礦化表面尤其是骨轉換活躍區有高度親和力，主要作用于破骨細胞，促進破骨細胞凋亡，抑制骨吸收。使用唑來膦酸干預后血清中骨吸收標志物尿Ⅰ型膠原氨基末端肽 (NTX)、血Ⅰ型膠原 C 端肽 (CTX)和骨形成標志物骨堿性磷酸酶 (BAP) 水平均下降[13]。我們的實驗證實了局部使用唑來膦酸可以明顯加速骨缺損的修復，加速局部骨礦化。

我們實驗中使用的ZA、PLGA、β-TCP復合材料修復效果明顯優于單獨的材料，原因可能在于唑來膦酸雖然可以抑制局部破骨細胞活性，但是其促進成骨的能力不佳；β-TCP由于其降解能力在骨質疏松狀態下明顯下降，12周時還可以見到大量的白色顆粒，因此限制了其修復骨缺損的能力，同時由于β-TCP降解減慢會占用了新生骨組織的區域，因此進一步減慢缺損的愈合。ZA、PLGA、β-TCP復合材料結合各自的優點，唑來膦酸可以充分發揮其抑制破骨的能力，相對而言成骨能力增強，加速β-TCP的降解，降解下來的Ca、P 離子能進入活體循環系統形成新生骨，因此互相作用，最終加速骨缺損的愈合。

本次試驗也有其局限性，首先我們實驗使用的大鼠數量有限，且時間較短，12周之后動物骨缺損修復的具體情況不知。我們沒有進一步從生化角度進一步觀察骨骼的具體改變，同時也沒有進一步探索機制。最后我們實驗使用的ZA劑量參考別的實驗中使用的劑量，同時治療骨缺損修復最佳的藥物劑量也不得而知，進一步確定最佳劑量也是下一步要考慮的事。

綜上所述，本次試驗雖然沒有從機制，生化方面進一步研究ZA、PLGA、β-TCP復合材料修復骨質疏松骨缺損，但是這次試驗從體內很好的證ZA、PLGA、β-TCP復合材料可以促進骨量的增加、加速骨組織的礦化來加速骨質疏松骨缺損的修復，該復合材料在臨床的使用有巨大的潛力。