桃紅四物湯對潑尼松誘導斑馬魚骨質疏松的治療作用

楊國柱 段濤 盧麗 陳珺 陸幸妍 李青南

廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006

桃紅四物湯源自于清代吳謙的《醫宗金鑒》由桃仁、紅花、當歸、白芍、熟地黃、川芎等 6 味中藥組成，是遵循“活血祛瘀”的原則所組成的基本復方，在各種血栓性疾病的治療，如血管性頭痛、冠心病、血栓性靜脈炎等方面，都取得了滿意的療效[1]；又有基礎研究[2]表明，桃紅四物湯在骨傷科方面有一定促進骨折愈合、改善頸椎病，腰腿痛等癥狀的作用，但其基礎機理和臨床應用有待于進一步的開發和研究。

隨著老齡化社會的到來，越來越多的老年問題也隨之出現。骨質疏松癥作為影響老年人日常生活的普遍問題之一，已得到普遍的關注和重視。在骨骼研究領域人們已經成功建立了許多動物骨骼模型，而新型模式生物斑馬魚則越來越受到人們的關注。斑馬魚個體小、易于飼養、 胚胎透明易于觀察和操作，易于觀察骨骼的發育[3-5]，并且它的重要器官即使出現畸形也能存活很長時間[6], 同時在研究領域還有些實驗樣品用量少、實驗周期短和可實現高通量篩選等優點。現代研究表明，其骨骼形成機制與哺乳動物一樣，且其參與調控的關鍵基因與哺乳動物的相關基因具有高度的同源性[7]，因此斑馬魚已被廣泛用于骨骼發育及相關疾病機制的研究與治療[8-11]。

因此，本研究利用斑馬魚模型，研究中藥復方桃紅四物湯對潑尼松誘導的斑馬魚骨質疏松的治療作用，為探討該復方對骨質疏松有無療效提供了科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥品與材料；10 μg/mL潑尼松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號28778)，依替膦酸二鈉(TargetMol，批號為T1210)，0.2% 鈣黃綠素(美國sigma公司, 批號為C0875-5G), 桃紅四物湯(桃仁9 g， 紅花6 g，當歸12 g，川芎6 g，白芍9 g，熟地黃12 g)，每個復方大約54 g，加10倍體積的水煎煮60 min，離心取上清，經低溫冷凍干燥成粉末狀，-80 ℃保存備用。解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡(AZ100，Nikon公司)；6孔板(Nest Biotech)；甲基纖維素(Aladdin, Shanghai, China)。

1.1.2實驗動物：野生型AB系斑馬魚，由浙江杭州環特生物公司提供，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后3天(3 dpf)，共180尾，用于評價桃紅四物湯對斑馬魚骨質疏松治療作用實驗。飼養于28 ℃的養魚用水中(水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μs/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)，實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.2 方法

1.2.1桃紅四物湯的最大耐受濃度(MTC)測定：隨機選取3 dpf正常野生型AB系斑馬魚于六孔板中，每孔(即每濃度組)30尾，用潑尼松處理正常斑馬魚建立斑馬魚骨質疏松癥模型，分別水溶給予桃紅四物湯 350、400、450和500 μg/mL 濃度，每孔容量為3 mL，同時設置正常對照組和模型對照組。28 ℃培養箱孵育一段時間后，觀察并統計斑馬魚死亡數量與毒性情況，確定桃紅四物湯對斑馬魚的最大耐受濃度(MTC)。

1.2.2桃紅四物湯對潑尼松誘導的骨質疏松的作用：隨機選取3 dpf正常野生型AB系斑馬魚于六孔板中，每孔(即每濃度組)30尾，用潑尼松處理正常斑馬魚建立斑馬魚骨質疏松癥模型，分別水溶給予桃紅四物湯50、150和450 μg/mL 濃度，陽性對照藥依替膦酸二鈉 300 μg/mL 濃度，每孔3 mL 容量，同時設置正常對照組和模型對照組。28 ℃ 培養箱孵育4 d 后，用0.2 % 鈣黃綠素進行染色，染色后進行拍照。采集數據，分析統計斑馬魚脊椎骨前三節的熒光強度(S)，桃紅四物湯對斑馬魚骨質疏松治療作用計算公式如下：

骨質疏松治療作用(%)=

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 桃紅四物湯對斑馬魚的最大耐藥濃度

通過對各濃度組桃紅四物湯引起斑馬魚幼魚死亡率的統計分析，結果顯示，桃紅四物湯在350、400和450 μg/mL 濃度時，斑馬魚反應正常，均未引起斑馬魚死亡。當濃度為500 μg/mL時，3.3 % 斑馬魚死亡，表明本實驗中，桃紅四物湯對斑馬魚的最大耐藥濃度MTC為450 μg/mL。因此，后續的骨質疏松治療作用的實驗濃度設置為50、150和450 μg/mL。詳見表1。

表1 桃紅四物湯對斑馬魚的最大耐藥濃度(n=30)Table 1 The maximum concentration of drug resistance of Taohong Siwu Decoction on zebrafish (n=30)

圖1 桃紅四物湯對斑馬魚骨質疏松的作用(n=30)A 潑尼松處理斑馬魚建立骨質疏松動物模型，設正常對照組和模型對照組，桃紅四物湯三個濃度組，依替膦酸二鈉組六個處理組，分別處理4 d；B定量分析斑馬魚脊椎骨前三節的熒光強度。30 次獨立重復實驗的結果用表示。與模型對照組比較，* P<0.05，** P < 0.01，***P<0.001Fig.1 Effect of different concentrations of Taohong Siwu Decoction on vertebral osteoporosis in zebrafish (n=30)A: Zebrafish osteoporosis models were established using prednisone and 6 study groups including Normal control group, Model group, Taohong Siwu Decoction groups of three different concentrations, and Etidronate disodium group received respective treatment for 4 days; B The fluorescence intensity of the first three vertebrae of zebrafish in different groups were measured using quantitative analysis.All data represent as the means±SD of thirty independent experiments.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001

圖2 桃紅四物湯對斑馬魚骨質疏松的治療作用(%)按公式(2.2)計算桃紅四物湯各組對骨質疏松的治療作用。與模型對照組比較(圖中未列出)，*P<0.05，***P<0.001Fig.2 Therapeutic effects of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis(%).The therapeutic effects of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis were calculated according to the formula (2.2); Compared with the model group (not in the figure),*P<0.05, ***P<0.001.

2.2 桃紅四物湯對潑尼松誘導的骨質疏松的作用

實驗共有6個組，為正常對照組，模型對照組，依替膦酸二鈉組和3個濃度的桃紅四物湯組，作用斑馬魚模型，結果見圖1～2，表2。

模型對照組的斑馬魚脊椎骨熒光強度小于正常對照組，P<0.01；陽性藥物依替膦酸二鈉組的斑馬魚脊椎骨熒光強度大于模型對照組，P<0.001，提示斑馬魚骨質疏松模型構建成功，也表示依替膦酸二鈉對斑馬魚骨質疏松具有明顯的治療作用。

桃紅四物湯在濃度為50 μg/mL和150 μg/mL時，對斑馬魚骨質疏松治療作用分別為16.4 %和17.8 %，斑馬魚脊椎骨熒光強度與模型對照組比較P>0.05，提示桃紅四物湯在50 μg/mL和150 μg/mL濃度時，對斑馬魚骨質疏松的治療作用不明顯；但桃紅四物湯在450 μg/mL濃度時，其斑馬魚骨質疏松治療作用為63.5 %，斑馬魚脊椎骨熒光強度與模型對照組比較P< 0.05；提示桃紅四物湯在450 μg/mL濃度時，對斑馬魚骨質疏松具有明顯的治療作用。

表2 桃紅四物湯對斑馬魚骨質疏松的治療作用(n=30)Table 2 Therapeutic effect of Taohong Siwu Decoction on zebrafish osteoporosis (n=30)

3 討論

桃紅四物湯作為活血化瘀類的經典中藥復方，方中熟地、白芍是血中的血藥，當歸、川芎是血中的氣藥，陰陽動靜相配，故能補血，又能和血，加入活血祛瘀的桃仁、紅花為主藥，突出了活血化瘀的作用，由于桃仁、紅花的活血作用比較緩和，再配合四物湯養血扶正，故本方是一首比較平和有效的活血祛瘀方劑[1]。中醫認為，脈者，血之府也，凡血液流通之處，皆可稱為血府，因此桃紅四物湯也被廣泛用于骨科各疾病的治療，如骨折、腰腿痛等[2]。

由于桃紅四物湯多在骨傷科方面用做壯骨強腎藥的輔助用藥，單獨探討其對骨質疏松癥作用的研究較為少見，本研究探討在潑尼松誘導的斑馬魚骨質疏松模型中，桃紅四物湯對其的最大耐藥濃度和治療作用，結果發現，在經潑尼松處理的斑馬魚骨質疏松模型組的基礎上，加入的桃紅四物湯在350、400和450 μg/mL 濃度時，斑馬魚反應正常，未有死亡。而在500 μg/mL 濃度時引起3.3%斑馬魚死亡，即本方對斑馬魚的MTC為450 μg/mL，在此基礎上，進一步評價了陽性對照藥和桃紅四物湯的抗骨質疏松活性，結果發現，依替膦酸二鈉的抗骨質疏松的作用略強于桃紅四物湯，而桃紅四物湯的療效存在著一定的量效關系，另一方面，提示斑馬魚骨質疏松模型也可用于中藥復方抗骨質疏松活性的療效關系研究。

由于斑馬魚骨質疏松模型是一種介于單細胞和整體哺乳動物之間的在體模式動物模型，可作為細胞實驗和常規動物實驗評價之間的橋梁，體積小而有完整骨骼，可實現在體、無損傷地快速觀察藥物的作用。這對開發我國豐富的中藥資源，尤其是能夠快速地發現和甄別具有抗骨質疏松作用或骨骼毒副作用的某些經典復方[12]，有著不可否認的促進作用。