淫羊藿次苷Ⅰ與其原型藥物淫羊藿苷對rBMSCs成骨性分化的影響比較

訾慧 孫麗 蔣寧 林庶茹 鄭洪新

遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110847

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加以致易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病。成骨細胞(osteoblast，OB)的增殖抑制、分化程度降低是造成骨質疏松的重要原因。現階段OP治療主要以雌激素、鈣劑、活性維生素D、降鈣素和氟化物等為常用藥物，雖然對OP有一定療效，但存在不良反應大及患者不能長期耐受等缺點。中醫認為，腎藏精，主骨生髓，髓藏于骨腔內，滋養骨骼，骨的生長發育依賴腎氣的滋養與推動。中醫臨床和實驗證明中醫藥治療原發性OP療效顯著，淫羊藿為中醫臨床治療骨質疏松或促進骨折愈合常用中藥。

淫羊藿，辛、甘，溫，歸腎、肝經。具有補腎壯陽，祛風除濕功效。淫羊藿苷(ICA)為淫羊藿主要活性成分，現代文獻報道其具有明顯的促進骨形成、抑制骨吸收的活性[1]。筆者前期的研究表明[2]，ICA經口服進入體內，經腸道細菌分解后會產生多種代謝產物如淫羊藿次苷I(IcarisideⅠ)，淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ)、淫羊藿素(Icaritin)等，在腎、肝、脾、肌肉等組織中分布濃度較高，并且與其代謝產物共存于組織中。另有報道ICA在體內的生物利用度較低[3]。IcarisideⅠ作為ICA主要體內代謝產物，在對抗骨質疏松促進OB分化方面的實驗研究未見報道。本實驗選用大鼠間充質干細胞作為研究對象，在體外誘導其成骨方向分化過程中，加入ICA、IcarisideⅠ，比較研究ICA及其主要代謝產物IcarisideⅠ對 rBMSCs成骨性分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑與藥品

試劑：DMEM/F12培養基(Gibco, USA)；甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(ASAP)、地塞米松、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；類標準胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；MEM-α細胞培養液(GIBCO 12571-063)、RNA提取試劑盒(QIAGEN74316)、cDNA反轉錄試劑盒(BIO-RAD170-8890)、堿性磷酸酶ALP測定試劑盒(AE91640Ra, 批號：201512)；骨鈣素BGP檢測試劑盒(AE90937Ra,批號：201512)；Ⅰ型膠原蛋白ELISA測定試劑盒(AE90739Ra，201512)；RNAisoReagent、反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、EasyDilution稀釋液均購自TaAaRa公司，引物由TaAaRa公司設計合成。

藥品：ICA購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415；IcarisideⅠ購于上海融禾醫藥科技有限公司，批號：121020。純度均大于 98%。

1.1.2儀器

二氧化碳細胞培養箱(THERMO FORMA 3110)、酶標儀(BIO-TECK Synergy H1)、凝膠成像儀(BIO-RAD，AIK9585) 預制膠 (BIO-RAD，Mini-PROTEANTMTGX)。熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P，德國安捷倫)；蛋白核酸分析儀(DU640，美國貝克曼)；低溫高速離心機(MR1822，法國Jouan SA)

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質干細胞培養及分組

大鼠骨髓間充質干細胞rBMSCs(購自廣州賽業有限公司)，采用胰蛋白酶消化法進行大鼠骨髓間充質干細胞的傳代。

實驗分組：①空白組：基礎培養液：DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)；②陽性轉化液對照組：成骨誘導液：DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)+0.1mol/L地塞米松+50 μg/mL維生素C+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。③ICA組：基礎培養液+ICA1×10-5mol/L；④IcarisideⅠ組：基礎培養液+ IcarisideⅠ1×10-5mol/L。

1.2.2堿性磷酸酶(ALP)活性測定

于成骨性誘導培養第6、9、12天測定ALP活性，具體方法如下：棄培養液，PBS洗2次，每孔加入緩沖液和基質液各0.3 mL混勻，37 ℃水浴15 min，加入0.9 mL顯色液，顯色后在紫外分光光度計上測定507 nm處光密度D(λ)值，空白調零，檢測酚標準及樣本的D(λ)值，根據公式換算為金氏單位。

1.2.3骨鈣素(BGP)含量的測定

成骨誘導培養后每3 d換液1次，每次換液時留取1 mL舊培養液，于-20 ℃保存，于成骨性誘導培養第6、9、12天，采用ELISA法檢測BGP的分泌量，以μg/孔表示。

1.2.4RT-RealTime PCR分析

藥物干預48 h，提取細胞RNA，實時定量PCR檢測相關基因(ALP、BGP、Osterix和Runx-2) 表達量。

所用引物均委托TaKaRa(大連)公司根據GeneBank所發布的序列設計并合成(表1)。總RNA的提取采用Trizol一步法進行, 使用核酸蛋白分析儀檢測吸光度。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行逆轉錄。使用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus試劑盒，以Stratagene Mx3000p熒光定量PCR儀進行檢測。逆轉錄體系、PCR擴增體系及反應條件均參照說明書設定。以標本中所提取的高濃度RNA逆轉錄得到的cDNA作為標準品，經等比稀釋后，進行PCR反應制備標準曲線。經內參校正，求得目的基因的相對表達水平。

表1 RT-Real Time PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-Real Time PCR

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對ALP活性的影響

檢測各組在第6、9、12 天ALP的活性及含量, 隨著培養時間的延長而增加。在第12天達到了高峰值。結果如圖1所示。

圖1 成骨性誘導后不同時間四組間ALP活性對比(n=8)注：與空白對照組比較，**P<0.01；與陽性轉化液組比較，▼▼P<0.01；與ICA組比較,△△P<0.01與空白對照組比較，除ICA組第9天外，各組ALP的活性及含量均顯著高于空白對照組(**P <0.01)；與陽性轉化液對照組比較，各組結果均有顯著差異(▼▼P<0.01)，但IcarisideⅠ組第12天ALP活性達到陽性轉化液組的近90%，與其最為接近；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個時間點對ALP活性的影響均強于ICA組(△△P<0.01)，并且在第9天即接近達到作用最高點，達到陽性轉化液組的近90%。Fig.1 Comparison of ALP activity in the four groups at different time after osteogenic induction

2.2 對BGP分泌量的影響

BGP分泌量隨著培養時間的延長而增加。檢測各組在第6、9、12 天BGP分泌量,在第12天達到了高峰值。結果如圖2所示。

圖2 成骨性誘導后不同時間四組間BGP分泌量對比(n=8)注：與空白對照組比較，**P<0.01，與陽性轉化液組比較，▼▼P<0.01；與ICA組比較，△△P<0.01與空白對照組比較，各組BGP分泌量均顯著高于空白對照組(**P <0.01)；與陽性轉化液對照組比較，各組結果均有顯著差異(▼▼P<0.01)，但IcarisideⅠ組第12天BGP分泌量達到陽性轉化液組的近86%；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個時間點BGP分泌量均強于ICA組(△△P<0.01)。Fig.2 Comparison of BGP secretion in the four groups at different time after osteogenic induction

2.3 ICA與IcarisideⅠ對rBMSCs骨向分化過程中ALP、BGP、Osterix、RUNX2 基因表達的影響

ALP、BGP、Osterix、Runx2的溶解曲線均只見一特異性峰, 表明引物的特異性好。各基因的擴增曲線均呈“S”型,表明擴增效率較高。各組細胞ALP、BGP、Osterix、RUNX2基因表達結果見表2。

3 討論

3.1 BMSCs 成骨分化過程中相關骨形成蛋白和細胞因子

骨髓間充質干細胞(BMSCs) 是一種多能間充質干細胞，在一定條件下可以向成骨、成脂、成軟骨分化。這個過程需要譜系特異性的轉錄因子如Runx-2、Osterix等參與。BMSCs 向成骨分化的重要表現是：細胞能夠合成、分泌表達成骨特異性的蛋白和細胞外基質成分，如早期出現的堿性磷酸酶、I型膠原蛋白等及較晚出現的骨鈣素、骨涎蛋白等[4]。

ALP是成骨細胞分泌的一種特異性的酶，標志著成骨細胞早期的分化程度[5]。BGP是成熟成骨細胞分泌的一種特異非膠原骨基質蛋白，是反映成骨細胞活性的敏感指標，也作為成骨細胞向新骨生成過程的特異性指標[6]。

Runx-2作為成骨細胞的特異轉錄因子和成骨細胞分化的關鍵調節因子，是骨發育過程中激活與啟動 BMSCs向成骨細胞分化并調節成骨細胞成熟的重要轉錄因子[7]。Runx2通過結合成骨細胞特異性激活元件，直接調節成骨細胞特異性基因的表達，包括骨鈣素、骨橋蛋白、I型膠原和ALP 等多種成骨相關基因的表達，在骨形成的多個階段起調控作用[8]。Osterix是Runx-2的靶基因，受到Runx-2的轉錄調控。Osterix是成骨細胞OB晚期分化所必需的特異性轉錄因子，調控許多重要的OB晚期表型和功能蛋白的表達，如骨鈣素、 骨橋素、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等，通過誘導前體成骨細胞分化為成熟的功能性成骨細胞，對骨細胞的分化成熟和骨質形成有重要影響[9]。

表2 各組細胞ALP、BGP、Osterix、RUNX2基因表達結果(n=5)Table 2 Gene expression of ALP, BGP, Osterix and RUNX2 in each group

注：與空白對照組比較，◇P<0.01；與陽性轉化液組比較，☆P<0.01； IcarisideⅠ組與ICA組比較，■P<0.01。
與空白對照組相比，ICA組和IcarisideⅠ組及陽性轉化液組ALP、BGP基因表達均顯著增高◇P<0.01，IcarisideⅠ組表達高于ICA組；與陽性轉化液組相比，ICA組、IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達均較低且☆P<0.01，IcarisideⅠ組的表達為陽性轉化液組的80%以上；IcarisideⅠ組與ICA組相比，IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達顯著增高，■P<0.01。
與空白對照組相比，ICA組和IcarisideⅠ組及陽性轉化液組Osterix、Runx-2基因表達均顯著增高◇P<0.01; 與陽性轉化液組相比，ICA組、IcarisideⅠ組Osterix、Runx-2基因表達均較低且☆P<0.01；IcarisideⅠ組與ICA組相比，無顯著性差異。

3.2 中醫理論“腎藏精”與干細胞相關性

中醫認為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養骨。腎中的精氣可以濡養和滋潤骨髓，骨的生長發育又有賴于骨髓的充養，腎中精氣旺盛則骨就強壯，否則反之。正如《醫經精義·五臟所主》所言：“腎藏精，精生髓，髓養骨，故骨者腎氣之所合也；髓者腎之所生也，精足則髓足，髓在骨內，髓足者則骨強。”這些論述表明出生后，甚至成年后“腎精”仍具有生成性，有再生的功能[10]。即“腎精”也擔負成年組織修復的功能。

《靈樞·決氣》，“腎藏精”精的來由是：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是為精”。因此，腎所藏之精可相應于胚胎干細胞及它分化為各種組織器官的成體干細胞。干細胞具有先天之精的屬性。現代醫學研究，干細胞是具有多向分化潛能的成體干細胞，以骨髓組織中含量最為豐富。骨髓間充質干細胞的分化能力與分化方向代表骨髓的功能，該功能由中醫“腎”的功能主宰，因此認為補“腎”可以增強骨髓間充質干細胞的分化功能。干細胞分化的潛能與中藥治療骨質疏松癥、骨折、骨壞死、骨缺損等骨相關疾病有著理論上的相通性。因此，中醫采用補腎中藥調控骨髓間充質干細胞向成骨分化的機制以“腎藏精生髓主骨”為理論基礎[11]。

3.3 淫羊藿苷及其代謝產物促進骨代謝的研究現狀

《本草綱目》：“淫羊藿味甘氣香，性溫不寒，能益精氣，乃手足陽明命門藥也”。中藥淫羊藿具有補腎壯陽，益精健骨的功效，是臨床治療OP常用藥，因其顯著的促進骨形成、抑制骨吸收作用一直是國內外研究的熱點。

ICA是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮苷類化合物，體外細胞實驗表明ICA可促進rBMSCs的成骨性分化，促進成骨細胞ALP活性，促進成骨細胞I型膠原的分泌，從而促進成骨細胞的增殖、分化和礦化，以及抑制破骨細胞的骨吸收活性[12,13]；ICA可通過上調成骨細胞核心結合因子α1 (Cbfα1)、BMP-2、BMP-4 mRNA和Runx2的表達而促進成骨細胞骨形成[14]。此外，ICA對化療藥物環磷酰胺導致小鼠骨髓間充質干細胞成骨分化障礙具有保護作用，可能與ICA激活Wnt/β-catenin 信號通路有關[15]。因而具有開發為抗骨質疏松新藥的潛力。

淫羊藿常以口服途徑給藥，主要成分ICA經腸道細菌分解后產生多種代謝產物，如IcarisideⅠ、IcarisideⅡ、icaritin等，而ICA生物利用度較低[16,17]，其代謝途徑見圖5。翟遠坤等[18]進行IcarisideⅡ對體外培養rBMSCs成骨性分化的影響，發現IcarisideⅡ促進BMSCs成骨性分化的活性高于ICA。IcarisideⅠ也是ICA的體內主要代謝產物之一，在對抗OP促進OB分化方面的實驗研究未見報道。因此本實驗研究IcarisideⅠ抗骨質疏松活性并與ICA活性進行比較。

圖3 淫羊藿苷代謝途徑與產物Fig.3 metabolic pathways and metabolites of icariin

3.4 ICA和IcarisideⅠ對主要成骨活性標志物ALP、BGP蛋白的影響

實驗發現，ICA和IcarisideⅠ均能夠促進BMSCs成骨性分化，具體表現在明顯提高ALP活性, 增加BGP分泌量, 且隨著培養時間的延長而增加。與正常對照組比較，除ICA組第9天外，各組ALP的活性及含量均顯著高于空白對照組(P<0.01)；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個時間點ALP活性及BGP分泌量均強于ICA組(P<0.01)。

3.5 ICA和IcarisideⅠ對ALP、BGP、Osterix和Runx-2基因表達的影響

實驗發現，ICA和IcarisideⅠ均可強烈促進成骨性分化因子ALP、BGP，上調體外培養的成骨細胞Runx-2，并可進一步調節其下游基因Osterix的轉錄表達，促進OB增殖、分化。與空白對照組比較，ICA和IcarisideⅠ組及陽性轉化液組ALP、BGP、Osterix、Runx-2基因表達均顯著增高P<0.01，但低于陽性轉化液組且P<0.01；IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達顯著高于ICA組且P<0.01。ICA組、IcarisideⅠ組Osterix、Runx-2基因表達相比，無顯著性差異。

結果表明，ICA作為淫羊藿的主要有效成分，經體內生物轉化后，其代謝物IcarisideⅠ也具有抗OP活性，并且其作用強于原型藥物ICA。根據中醫理論，腎中精氣充盛，對骨形成有較好的促進作用，其作用機制與其能夠促進ALP、BGP、Osterix、Runx-2基因及蛋白表達有關。提示ICA可通過口服途徑給藥，進行抗骨質疏松藥效學評價。IcarisideⅠ與ICA比較，主要差別在于脫去3位鼠李糖，這可能是活性增強的主要原因，但具體機理還需做進一步的研究。