NF-κB抑制劑PDTC對人骨髓瘤U266細胞增殖和凋亡的影響*

易 蓓， 袁海汀， 許永會， 羅 綦， 曾沉思， 陳建斌

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液科，重慶 400016)

NF-κB抑制劑PDTC對人骨髓瘤U266細胞增殖和凋亡的影響*

易 蓓， 袁海汀， 許永會， 羅 綦， 曾沉思， 陳建斌△

(重慶醫科大學附屬第一醫院血液科，重慶 400016)

目的： 探討NF-κB特異性抑制劑PDTC對多發性骨髓瘤U266細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制。方法: 采用不同濃度PDTC (25、50、100和200 μmol/L)處理U266細胞，CCK-8法和活細胞計數檢測U266細胞的增殖活性；流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞周期；RT-qPCR及Western blot檢測PDTC處理前后DNA甲基轉移酶1(DNMT1) mRNA和蛋白的表達；Western blot檢測NF-κB (P65)、DNMT1、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平。結果: PDTC處理U266細胞48 h后，NF-κB (P65)的蛋白水平被抑制；PDTC抑制U266細胞增殖，作用呈濃度及時間依賴性；PDTC作用48 h后，與對照組比較，細胞凋亡率呈濃度依賴性增高(P<0.05)，細胞被阻滯在G2期；DNMT1的mRNA及蛋白水平均降低；Western blot結果顯示PDTC可通過抑制NF-κB下調Bcl-2的表達，使cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平增加。結論: PDTC抑制NF-κB信號通路，通過誘導U266細胞凋亡從而抑制細胞增殖，其機制可能與抑制DNMT1的表達、阻滯細胞周期和啟動凋亡途徑有關。

NF-κB； PDTC； 多發性骨髓瘤； 細胞凋亡； DNA甲基轉移酶1

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，約占血液系統惡性腫瘤的13%，全世界每年大約86 000的新增病例[1]。近年由于新型藥物的應用及造血干細胞移植技術的發展使得該病得到極大緩解，但復發和耐藥問題仍未得到有效解決[2]，積極尋求新的藥物及治療手段仍是一項重大課題。

NF-κB是一類重要的核轉錄因子，可以調控多種基因從而發揮多種生物學功能，包括調節細胞凋亡、參與炎癥反應過程、調控細胞周期、參與腫瘤的發生及耐藥等[3]。研究顯示，NF-κB與血液系統腫瘤密切相關，在髄系白血病、淋巴細胞白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中均有高活性[4-7]。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種金屬螯合物，分子量為164.29 kD，具有抗氧化作用，是NF-κB信號通路特異性抑制劑。本研究采用PDTC抑制NF-κB，觀察其對MM U266細胞增殖和凋亡的影響，探究PDTC對U266細胞增殖的抑制作用及可能的相關機制，為臨床應用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

人骨髓瘤U266細胞由第二軍醫大學長征醫院侯建教授惠贈。將PDTC(Sigma)用PBS配成10 mmol/L的儲存液，使用前稀釋成不同濃度的工作液；RPMI-1640和二甲基亞砜(Sigma)；胎牛血清(Gibco)；細胞周期和凋亡檢測試劑盒(凱基生物)；CCK-8試劑盒、蛋白提取試劑盒和BCA測蛋白濃度試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；引物合成、Trizol reagent和逆轉錄及PCR試劑盒(TaKaRa)；抗β-actin抗體和抗DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)抗體(Santa Cruz)；抗Bcl-2和cyclin D1抗體(Abcam)；抗cleaved caspase-3和cleaved caspase-8抗體(上海生工)。

2 主要方法

2.1 細胞培養 U266細胞于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養，每1～2 d換液，2～4 d傳代。取對數生長期細胞進行相關實驗。

2.2 CCK-8法及活細胞計數檢測PDTC對U266細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的U266細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，每孔總體積100 μL。分別加入10 μL不同濃度的PDTC，使終濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L，各組設5個復孔，培養24、48和72 h后，向每孔中避光加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2～4 h，在酶標儀450 nm波長測其吸光度(A)值，細胞生長抑制率(inhibitory rate, IR)按如下公式計算。IR (%)=[1-(A實驗組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)]×100%。另取U266細胞接種于6孔板中，每孔2×105個，每孔總體積4 mL，分別加入等體積不同濃度的PDTC，終濃度同上所述，培養24、48和72 h后，取適量細胞懸液與0.2%臺盼藍混合染色至計數板上計數。

2.3 流式細胞術檢測U266細胞凋亡和細胞周期的變化 取對數生長期的U266細胞，調整細胞密度為2×108/L，將其接種于6孔板中，每孔總體積4 mL，往各孔中分別加入等體積不同濃度的PDTC，使終濃度為0、25、50、100和200 μmol/L，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養48 h，收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，去上清液，用PBS洗滌2次，將細胞重懸于500 μL PBS中，送重慶醫科大學生命科學院流式細胞檢測中心按Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明進行細胞凋亡檢測。同樣的方法收集細胞，用70%冰乙醇4 ℃固定過夜，送流式細胞檢測中心進行細胞周期檢測。

2.4 RT-qPCR法檢測目的基因的表達 β-actin的上游引物序列為5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，產物長度132 bp； DNMT1的上游引物序列為5′-AGACTACGCGAGATTCGAGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGGTGGCGTAGTAGTAGAGG-3′，產物長度171 bp。總mRNA的提取按照氯仿-異丙醇法進行。經紫外光分光光度計檢測其濃度和純度，按逆轉錄試劑盒說明(TaKaRa)總體系20 μL逆轉錄，得到各組cDNA。PCR反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，共進行40個循環。每個樣本設置3個復孔，實驗重復3次。

2.5 Western blot法檢測NF-κB (P65)、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和DNMT1的蛋白水平 同樣的方法收集PDTC處理后的細胞，用核蛋白和總蛋白抽提試劑盒說明書，取上清液按BCA法測蛋白濃度說明書檢測蛋白濃度。沸水浴5 min使蛋白變性。每組按照30 μg 蛋白量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入相應 I 抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min、3次，加入相應 II 抗(1∶2 000)在37 ℃孵育1 h，接著用TBST洗膜10 min、3次。PVDF膜化學發光檢測，用FUSION凝膠成像分析軟件分析條帶。

3 統計學處理

所有實驗至少重復3次，結果采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較時采用Turkey 法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 PDTC抑制NF-κB (P65)結果檢測

如圖1所示，50和100 μmol/L的PDTC作用于U266細胞48 h后，Western blot檢測細胞核中NF-κB(P65)蛋白水平與對照組相比明顯降低(P<0.01)。

2 PDTC對U266細胞增殖的影響

用終濃度為0、25、50、100和200 μmol/L的PDTC分別作用于U266細胞，培養24、48和72 h后加入CCK-8試劑，酶標儀測吸光度值，結果表明：PDTC作用48 h和72 h的2個時間組中，在25～200 μmol/L的濃度梯度范圍內，隨著PDTC濃度的增加，生長抑制率明顯升高(P<0.01)；作用24 h組，未能顯示濃度遞增與效應的相關性，見圖2A。同時，細胞計數結果顯示，不同濃度PDTC作用24 h，細胞數無明顯減少；隨著作用時間延長至48 h或72 h，細胞數量隨PDTC濃度的增加逐漸減少，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2B。兩者表明，PDTC抑制U266細胞增殖，作用呈濃度及時間依賴性。

Figure 1.The protein level of NF-κB (P65) in the U266 cells treated with PDTC detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 Western blot 檢測PDTC作用于U266細胞后NF-κB(P65)的蛋白水平

Figure 2.The effect of PDTC on the proliferation of U266 cells. A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs25 μmol/L group;##P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 PDTC對U266細胞的增殖抑制的檢測結果

3 PDTC對U266細胞周期和凋亡的影響

采用不同濃度PDTC作用于U266細胞48 h，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡。結果顯示與對照組相比，G2期的細胞所占比例相對增多(P<0.01)，但大多數細胞處在S期，見圖3、表1。總的凋亡率隨PDTC濃度的增加而上升，當濃度達100 μmol/L后，細胞凋亡率近最大值，PDTC組均較對照組有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

4 PDTC對U266細胞Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平的影響

PDTC處理U266細胞后，收集各組細胞提取蛋白，Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，Bcl-2的蛋白水平明顯下降，其蛋白水平受抑制程度與PDTC濃度呈正相關，差異有統計學意義(P<0.01)。Cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平隨著PDTC濃度的增加而升高，在濃度為200 μmol/L時差異更加明顯(P<0.05)，見圖5。

5 PDTC對U266細胞DNMT1的mRNA和蛋白水平的影響

不同濃度的PDTC處理U266細胞48 h后，RT-qPCR測定DNMT1的mRNA表達，結果顯示與對照組相比，PDTC組DNMT1的mRNA表達降低(P<0.01)。Western blot實驗結果顯示，PDTC處理后DNMT1蛋白水平明顯下降，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。且隨著PDTC濃度的增加，DNMT1蛋白水平呈逐漸降低趨勢，在100 μmol/L時差異較顯著(P<0.01)，見圖6。

Figure 3.Influence of PDTC on the cell cycle of U266 cells.

圖3 流式細胞術檢測PDTC對U266細胞周期的影響

表1 流式細胞術檢測不同濃度PDTC對U266細胞周期的影響

**P<0.01vs0 μmol/L group.

Figure 4.The apoptotic rate of U266 cells increased with the increasing concentrations of PDTC for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4 流式細胞術檢測PDTC作用于U266細胞48 h的細胞凋亡率

Figure 5.The protein levels of cyclinD1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 in PDTC groups were higher than those in control group but Bcl-2 decreased. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖5 Western blot 檢測不同濃度PDTC對U266細胞cyclin D1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和Bcl-2的蛋白水平

Figure 6.The effect of PDTC on the expression of DNMT1 at mRNA (A) and protein (B) levels determined by RT-qPCR and Wes-tern blot, respectively. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖6 Western blot和RT-qPCR檢測PDTC作用于U266細胞后DNMT1的mRNA和蛋白表達情況

討 論

多發性骨髓瘤是漿細胞異常增殖的一種血液系統惡性腫瘤，主要累及老年人。目前，由于新型藥物如沙利度胺、硼替佐米和來那度胺的應用，極大改善了病人的總體生存率，但復發和死亡率仍很高，該病仍是不可治愈的血液腫瘤[8]。因此，如何積極有效地抑制骨髓瘤細胞的增殖，探尋更加有效的藥物和治療手段是目前骨髓瘤治療的關鍵。

NF-κB 是重要的轉錄因子家族的成員，由P50、P52、c-Rel、P65/RelA和RelB組成。NF-κB信號通路參與調節多種腫瘤的病理過程，與血液腫瘤的發生、增殖、凋亡密切相關。研究表明，在部分情況下NF-κB有促進細胞凋亡的作用，但大多數情況下可誘導多種腫瘤細胞的增殖，發揮抗凋亡的作用[9]。抑制NF-κB的活性可以增加腫瘤細胞的凋亡。文獻報道，在MM中，NF-κB持續激活參與了MM的發生發展[10]。但在MM中，NF-κB高活性的具體原因我們不得而知。PDTC是氨基甲酸鹽的一種，屬于抗氧化劑，也作為NF-κB特異性抑制劑。其主要通過抑制IκB降解或者抑制NF-κB (P65)，阻礙NF-κB的向核移位，從而達到抑制NF-κB活性的作用。體外實驗表明，PDTC可抑制多種腫瘤細胞的增殖[11-13]。本研究采用PDTC抑制NF-κB信號通路，觀察其對MM U266細胞增殖和凋亡的影響，結果表明，PDTC能呈濃度和時間依賴性抑制U266細胞的增殖，誘導其凋亡，并且有G2期阻滯的作用。這些表明PDTC通過抑制NF-κB信號通路活化抑制了MM U266細胞的增殖，其機制可能與抑制NF-κB相關抗凋亡通路有關。

Bcl-2家族是重要的凋亡調節因子，包括抗凋亡基因和促凋亡基因，其中抗凋亡蛋白成員，比如Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w 是通過阻礙caspase活化或線粒體膜電位的降低和細胞色素C的釋放發揮作用[14]。caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸水解酶，對于調控真核細胞凋亡過程起了重要作用，caspase的激活即代表細胞凋亡過程的進行。Caspase的一步步激活，高選擇性切割一些蛋白質來誘導細胞凋亡[15-16]。在我們的研究中選擇具有代表性的Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8作為凋亡的觀測指標，發現PDTC通過抑制NF-κB，使Bcl-2的蛋白水平降低，cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平升高，且隨著PDTC濃度的改變而相應的變化。細胞凋亡受細胞內外因子調控，NF-κB的激活能誘導抗凋亡基因的表達，從而促進細胞存活，因此，NF-κB是調控細胞凋亡重要的轉錄因子。在本研究中，我們用PDTC作用于U266細胞，抑制了NF-κB，并且可能通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活caspase-3等關鍵酶，作用于caspase-8和線粒體的上游從而誘發細胞凋亡途徑。這與Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡結果一致，但其具體誘導凋亡的途徑還不清楚，有待進一步研究。

我們用流式細胞術檢測細胞周期時多次重復實驗結果顯示，與對照組比較，PDTC作用后G2期細胞相對增多，Western blot 結果顯示細胞周期蛋白cyclin D1蛋白水平呈增高趨勢。Hwang等[17]在研究β-catenin 和NF-κB 信號通路與cyclin D1關系時，發現cyclin D1的轉錄激活能被NF-κB(P65)抑制。我們的結果也顯示PDTC抑制NF-κB信號通路，反饋性引起cyclin D1的表達升高。Cyclin D1調控細胞周期由G1至S期發展，這可能解釋了我們的結果中S期細胞高比率的原因。而PDTC對cyclin D1的調控機制可能有待更深入的研究。

在MM中，我們前期的研究表明一種抑癌基因PCDH10由于甲基化而表達減少或缺失[18]，而甲基化過程與DNMTs (包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)的表達密切相關。國內外研究證實DNMTs 在骨髓瘤中異常高表達[19]，我們前期也檢測了骨髓瘤病人與正常人骨髓中DNMTs 的mRNA表達情況，得到同樣的結果(數據未列出)。DNMT1是重要的甲基轉移酶，其在MM U266細胞中異常高表達。有文獻研究表明，在急性髓系白血病中，硼替佐米可以通過Sp1/NF-κB通路下調DNMT1的表達，從而誘導基因組DNA低甲基化[20]。因此，我們猜測NF-κB與DNMT1的表達有關，在本實驗中，加入PDTC后，從RT-qPCR 和Western blot 結果中我們觀察到DNMT1在基因和蛋白水平均受到明顯抑制。這表明PDTC可能通過抑制NF-κB參與了對DNMT1的間接調控，也表明在多發性骨髓瘤中，NF-κB與DNMT1存在一定的聯系。這一結果對于進一步研究PDTC在骨髓瘤中的作用及與抑癌基因甲基化的關系提供了依據。

綜上所述，本實驗通過PDTC抑制NF-κB信號通路，發現PDTC可抑制MM U266細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與抑制Bcl-2的表達，活化caspase-3和caspase-8的表達有關。并且PDTC通過抑制NF-κB從而抑制DNMT1的表達，為PDTC在MM中的進一步研究應用提供了理論依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells

YI Bei, YUAN Hai-ting, XU Yong-hui, LUO Qi, ZENG Chen-si, CHEN Jian-bin

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqchenjianbin2007@126.com)

AIM: To explore the effect of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), an NF-κB inhibitor, on the proliferation and apoptosis of human multiple myeloma U266 cells and its mechanisms. METHODS: The U266 cells were treated with PDTC at different concentrations (0, 25, 50, 100 and 200 μmol/L)invitro. The growth inhibitory rate of the U266 cells was detected by CCK-8 assay and cell counting. The cell cycle of the U266 cells was determined by flow cyto-metry, and the apoptosis was examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The effect of PDTC on the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) at mRNA and protein levels was measured by RT-qPCR and Western blot, respectively. The effects of PDTC on the protein levels of NF-κB (P65), DNMT1, Bcl-2, cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: The protein level of NF-κB (P65) was decreased after treatment with PDTC for 48 h or 72 h. PDTC inhibited the proliferation of U266 cells in both dose- and time-dependent manners. After treatment with PDTC for 48 h, the percentage of U266 cells in G2phase increased compared with control group (P<0.05). PDTC induced the apoptosis of U266 cells in a dose-dependent manner. The expression of DNMT1 at mRNA and protein levels decreased (P<0.05). The results of Western blot showed that the expression of Bcl-2 in PDTC groups decreased, while the protein levels of cyclin D1, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 were higher than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: The NF-κB inhibitor PDTC inhibits the proliferation of U266 cells by inducing cell apoptosis. It may be related to the down-regulated expression of DNMT1, cell cycle arrest and activation of the apoptotic pathways.

NF-κB; PDTC; Multiple myeloma; Apoptosis; DNA methyltransferase 1

1000- 4718(2017)07- 1177- 07

2016- 11- 10

2017- 03- 09

重慶市衛生計生委科研計劃項目(No. 2011-1-032)

R733.3； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.004

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