橄欖油中蠟含量測定方法的改進及氣質聯用分析

柴 杰 薛雅琳 金青哲 王興國 張 東

(江南大學食品學院1，無錫 214122) (國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

橄欖油中蠟含量測定方法的改進及氣質聯用分析

柴 杰1,2薛雅琳2金青哲1王興國1張 東2

(江南大學食品學院1，無錫 214122) (國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

利用硅膠固相萃取柱凈化，四氯化碳洗脫，從橄欖油中分離出蠟質組分，內標法定量，氣相色譜測定蠟含量，氣相色譜-質譜聯用分析蠟質組成。結果表明，加標回收率為79.95%～94.03%，相對標準偏差(RSD)為0.85%～1.70%。GC-MS分析得出蠟質主要成分為長碳鏈脂肪酸和長碳鏈脂肪醇組成的長碳鏈脂肪族蠟質，相同碳數及飽和程度的蠟質有多種組成，單不飽和蠟質主要由棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)與相應的長碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成，含量高于飽和蠟質。

橄欖油 蠟含量 固相萃取 氣相 氣質聯用

初榨橄欖油是采用機械壓榨等物理方式直接從油橄欖果中制取[1]，因豐富的營養成分，宜人的香氣深受消費者的青睞，被譽為“液體黃金”。巨大的經濟利益誘使生產商將低等級的精煉橄欖油、混合橄欖油和橄欖果渣油摻入初榨橄欖油中以次充好，牟取暴利。目前橄欖油摻偽研究方法包括液相色譜法[2]、核磁共振光譜法[3]、紅外線光譜法[4]、熒光光譜法[5]和化學計量分析法[6]。

橄欖油中含有多種蠟質，包括長碳鏈脂肪酸和短碳鏈脂肪醇(C1～C6)或長碳鏈脂肪醇(C22～C28)形成的脂肪族蠟質、苯甲醇酯、甾醇酯等，主要以長碳鏈脂肪酸與長碳鏈脂肪醇形成的脂肪族蠟質為主[7]。不同等級的橄欖油蠟含量不同，初榨橄欖油中蠟含量少，通過測定橄欖油中蠟含量能有效判定橄欖油等級，國際橄欖油協會(IOC)及中國國家標準委員會通過測定長碳鏈脂肪族蠟質含量制訂了COI/T.20/Doc.No.28/(2010)[8]和GB/T 22501—2008[1]2個標準，標準規定根據C40～C46偶碳數脂肪族蠟質含量鑒定橄欖油等級。

IOC及GB方法利用人工裝填的硅膠柱層析洗脫，將弱極性的蠟質組分先于甘油三酯洗脫下來，內標法定量，氣相色譜法測定蠟含量，此方法不破壞蠟質組成，能準確定量蠟質組分，但人工裝填層析柱等步驟耗時耗力，此后有學者優化了前處理，Amelio等[9]利用液相色譜分離蠟質組分，簡化了步驟。有學者利用氣相色譜測定蠟含量及氣相色譜質譜聯用分析蠟質組成，氣相色譜根據蠟質碳原子數及不飽和度進行分離從而測定總量，利用GC-MS可對蠟質進行定性分析及同分異構組成研究。Reiter等[10]利用SPE固相萃取小柱分離茴香和香菜種子油中蠟質，氣相色譜法測定蠟含量，方法節約了前處理時間。Bianchi等[7]通過GC-MS分析橄欖果渣油的蠟質組分，其主要成分為油酸或棕櫚酸與長碳鏈脂肪醇(C22～C28)形成的單不飽和長碳鏈脂肪族蠟質。Reiter等[11]通過質譜分析得出，橄欖油中蠟質含有不同碳鏈長度的酯類，包括短碳鏈脂肪族酯類，長碳鏈脂肪族飽和酯類，長碳鏈脂肪族不飽和酯類，芐基酯，二萜酯等。

本試驗利用SPE固相萃取小柱分離橄欖油中蠟質，內標法定量，氣相色譜測定C40～C46偶碳數脂肪族蠟質含量，建立了一種快速簡便的橄欖油蠟含量測定方法，有效鑒定橄欖油等級，同時利用GC-MS分析了橄欖油中C40～C46偶碳數脂肪族蠟質組成，為蠟質組分分析提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級初榨橄欖油，混合橄欖油；正己烷(色譜純)，正庚烷(色譜純)：Fisher Science；硝酸銀、四氯化碳、正己烷、乙醚：北京化工試劑廠；花生酸月桂醇酯(C32酯)、C40酯標準品、蘇丹Ⅰ：Sigma公司；硅膠(100～200 μm)：青島海洋化工工廠。

GC2010氣相色譜儀，SPL進樣口，FID檢測器：島津公司；Agilent 7890-5975C氣相色譜-質譜聯用，DB-5HT毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm)：Agilent公司；SPE固相萃取小柱(1 g硅膠6 mL容量)：上海安譜科學儀器公司；SX-4-10馬弗爐：天津泰斯特儀器有限公司；R-215型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；玻璃層析柱(d=1.5 cm,l=40 cm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 柱層析分離蠟組分

硅膠固相萃取柱，上樣前用正己烷活化，準確稱取橄欖油20～25 mg，加入200 μL 0.01 mg/mL內標物(花生酸月桂醇酯，C32酯)，上樣，2次200 μL正己烷清洗試管使轉移徹底，6 mL四氯化碳洗脫，收集洗脫液，弱氮氣流吹干溶劑，加150 μL正庚烷，氣相色譜及GC-MS分析。

人工裝填硅膠柱分離橄欖油中蠟質組分同GB/T 22501—2008。

1.2.2 氣相色譜法測定蠟含量

氣相色譜條件：DB-5HT毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.10 μm)，程序升溫：初始溫度200 ℃，保持1 min，20 ℃/min程序升溫至300 ℃，2 ℃/min程序升溫至346 ℃，保持26 min；高純氦氣，流速1.5 mL/min；SPL進樣口，溫度340 ℃，進樣量1.0 μL，分流比10∶1；FID檢測器，350 ℃。

蠟含量=[A(W)×m(IS)×1 000]/[A(IS)×m]

式中：A(W)：蠟質(C40酯～C46酯)峰面積；m(IS)：內標質量/mg；A(IS)：內標物峰面積；m：樣品質量/g。

總含蠟量=Σ [C40酯含量～C46酯含量]

1.2.3 GC-MS分析

氣相色譜條件：同1.2.2；MS條件：電子轟擊源(EI源)，溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲8 min，質量范圍(m/z)：50～800。

1.2.4 蠟質定性分析

采用蠟質酯基斷裂后形成的脂肪酸和脂肪醇離子碎片確定蠟質結構，以定性碎片離子占該峰總定性碎片離子的百分含量確定蠟質組成，同Bianchi、Reiter等[7, 10-11]的分析方法。

2 結果與討論

2.1 橄欖油蠟含量測定

橄欖油中蠟質以C40～C46偶碳數的脂肪族蠟質為主，不飽和蠟質出峰先于飽和蠟質[11]，蠟含量以C40酯～C46酯偶碳數脂肪族蠟質總和表示，不同等級的橄欖油蠟含量不同，初榨橄欖油中蠟含量少，混合橄欖油中蠟含量高。根據標準品出峰及文獻譜圖對照，蠟質組成依次為，1∶WE40∶1，2∶WE40∶0，3∶WE42∶1，4∶WE42∶0，5∶WE44∶1，6∶WE44∶0，7∶WE46∶1，8∶WE46∶0。相同碳鏈長度的蠟質不飽和蠟質含量高于飽和蠟質，Reiter等[11]也得出相同結論。

圖1 特級初榨橄欖油中蠟含量氣相色譜圖

2.1.1 方法的線性范圍及檢出限

由IOC及GB方法可知，C40酯等脂肪族蠟質與花生酸月桂醇酯(C32酯)的響應值比近似為1，將C40酯標準品用正庚烷稀釋成0.19、0.095、0.047 5、0.019、0.009 5、0.000 95 mg/mL系列質量濃度，按照1.2.2氣相色譜條件進行測定。峰面積為縱坐標y，C40酯質量濃度為橫坐標x，曲線方程為y=1.959 8×106x-2.330 5×103，相關系數R2為0.999 4，線性范圍0.000 95～0.19 mg/mL，表明在0.000 95～0.19 mg/mL范圍內線性關系良好。方法的最低檢出限以基線噪音的3倍所對應的質量濃度，該方法的最低檢出限為0.095 μg/mL。

2.1.2 方法的精密度、加標回收率及準確度

取一橄欖油樣對其蠟含量進行6次重復試驗測定，蠟含量分別為68.74、70.22、68.59、65.74、65.95、65.61 mg/kg，均值為67.47 mg/kg，變異系數為2.91%。再取18份該橄欖油油樣，每6份為1組，分為3組，每組依次加入0.011 9 mg/mL C40酯正己烷溶液60、120、200 μL，按1.2.1中改進法及1.2.2進行蠟質分離及蠟含量測定。平均回收率及每個加標量條件下的6次試驗的相對標準偏差(RSD)見表3。

表1 橄欖油中C40酯加標回收率及準確度(n=6)

方法加標回收率為79.95%～94.03%，試驗過程中相對標準偏差(RSD)為0.85%～1.70%(n=6)，表明該方法精密度及準確度良好。

2.1.3 實際樣品測定及與GB/T 22501—2008方法比較

選取2個橄欖油樣品，分別采用改進方法和GB/T 22501—2008方法對其總蠟含量及C40酯～C46酯各單酯含量進行測定，測定結果見表2。比較得出，2種方法都能有效的測定橄欖油中總蠟含量及蠟質各單酯含量，且2種方法在總蠟含量及C40～C46酯各單量的測定結果相近。

表2 實際樣品測定與國標法比較(n=2)

改進的方法主要優化了前處理，采用分流進樣口進樣。SPE固相萃取小柱能有效替代人工裝填的硅膠柱，縮短前處理時間，提取效率快，同時避免人工裝柱及洗脫的不穩定性，耐用性強，在色譜條件選擇，使用SPL分流進樣，減少了對色譜柱的污染，選用DB-5HT耐高溫低流失氣相色譜柱，基線穩定，耐受較高溫度的同時確保良好的分離效果，色譜圖出峰尖銳。2種方法比較見表3。

表3 IOC法、GB法與改進法方法比較

2.2 橄欖油蠟質GC-MS分析

氣相色譜中每一個蠟質峰中包含相同碳數、相同飽和程度的多種不同脂肪酸-脂肪醇組成的蠟質[10]，蠟質結構表示為R1-COO-R2，R1代表組成蠟質的長碳鏈脂肪酸組分，R2代表組成蠟質的長碳鏈脂肪醇組分，飽和蠟質中檢測出母離子峰[M]+，因Mclafferty重排產生的[R1CO2H2]+，[R1CO]+和[R2-1]+，不飽和蠟質中檢測出Mclafferty重排產生的[R1CO2H2]+， Mclafferty裂解蠟質中不飽和脂肪酸組分產生的[R1CO-1]+，同Reiter等[11]的測定結果。

根據Bianchi和Reiter等[7, 11]的方法，采用蠟質酯基斷裂形成的脂肪酸和脂肪醇離子碎片確定蠟質結構，以定性碎片離子占該峰總定性碎片離子的百分含量確定蠟質組成，以[R1CO2H2]+、[R1CO]+和[R2-1]+碎片離子確定飽和蠟質的中各組成的百分含量，以[R1CO2H2]+和[R1CO-1]+碎片離子確定不飽和蠟質中各組成的百分含量，分析特級初榨橄欖油中蠟質組成成分，測定結果見表4。

表4 特級初榨橄欖油蠟質組成成分質譜鑒定結果

注：a:CN蠟質碳鏈長度；DB雙鍵數；WE蠟質；b:acid-alcohol，組成蠟質的脂肪酸-脂肪醇；c:該種脂肪酸-脂肪醇組成占此碳數蠟質組成的百分含量；d:離子碎片的相對百分峰度；e:[]表示未檢出。

通過GC-MS分析可對特級初榨橄欖油中C40～C46偶碳數脂肪族蠟質中相同碳數單不飽和蠟質及飽和蠟質組成進行確定，根據表4可知，相同碳數及相同飽和程度的蠟質有多種不同的脂肪酸-脂肪醇組成，不飽和長碳鏈脂肪族蠟質主要由棕櫚油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)與長碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成，油酸(C18∶1)與長碳鏈脂肪醇組成的不飽和脂肪族蠟質含量更高。飽和脂肪族蠟質主要為棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生酸(C20∶0)、山崳酸(C22∶0)與相應的長碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成。相同碳數脂肪族蠟質，單不飽和蠟質出峰先于飽和蠟質，單不飽和蠟質含量高于飽和蠟質含量，分析結果與氣相色譜法推斷結果相同。

3 結論

3.1 建立了一種快速準確測定橄欖油蠟含量的方法，方法加標回收率為79.95%～94.03%，試驗過程中相對標準偏差(RSD)為0.85%～1.70%。前處理利用商業成品SPE固相萃取小柱，操作簡便、重復性好，有效避免人工裝填硅膠柱引起的誤差，有機溶劑使用量少，總測定時間短，提取效率快，耐用性強。

3.2 利用碎片離子峰進行定性，在不經皂化破壞蠟質結構的條件下對脂肪族蠟質組成進行分析，分析了C40～C46飽和及單不飽和脂肪族蠟質的組成，相同碳數及飽和程度的蠟質有多種組成，單不飽和脂肪族蠟質含量高于飽和脂肪族蠟質。

[1]GB/T 22501—2008 動植物油脂 橄欖油中蠟含量的測定 氣相色譜法[S]. 2008 GB/T 22501—2008 Animal and vegetable fats and oils—Determination of wax content of olive oils by gas chromatography [S]. 2008

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Improvement of the Determination Method of Wax Content in Olive Oils and Analysis by GC-MS

Chai Jie1,2Xue Yalin2Jin Qingzhe1Wang Xingguo1Zhang Dong2

(School of Food Science, Jiangnan University1, Wuxi 214122) (Academy of State Administration of Grain2, Beijing 100037)

The waxy component of olive oil was obtained by silica gel solid phase extraction column purification, carbon tetrachloride elution, and internal standard method quantification, subsequently the wax content measured by gas chromatography and the waxiness composition analysized by gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the adding standard recovery was 79.95%～94.03%, with the relative standard deviation (RSD) of 0.85%～1.70%. With respect to the GC-MS analysis, the main component of the wax was long carbon chain fatty esters and long carbon chain aliphatic series waxiness which were composed of long carbon chain fatty alcohol. The waxiness of the same carbon number and same degree of saturation had various components, and monounsaturated waxiness was mainly composed of palmitoleic acid (C16∶1), oleic acid (C18∶1) and the corresponding long carbon chain fatty alcohol (C20～C32), the content of unsaturated waxiness were higher than saturated waxiness.

olive oil， wax content， solid-phase extraction，gas chromatography， GC-MS

公益性行業(糧食)科研專項(201313006-3)

2015-07-21

柴杰，男，1990年出生，碩士，糧油食品檢驗

薛雅琳，女，1960年出生，教授級高級工程師，糧油質量與檢測

TS227

A

1003-0174(2017)02-0135-05