好氧污泥-微藻耦合顆粒的培養及特性研究

劉 琳,葉嘉琦,劉玉洪,2,黃 栩,劉超翔*(.中國科學院城市環境研究所,中國科學院城市污染物轉化重點實驗室,福建 廈門 3602；2.中國科學院大學,北京 00049)

好氧污泥-微藻耦合顆粒的培養及特性研究

劉 琳1,2*,葉嘉琦1,劉玉洪1,2,黃 栩1,劉超翔1*(1.中國科學院城市環境研究所,中國科學院城市污染物轉化重點實驗室,福建 廈門 361021；2.中國科學院大學,北京 100049)

研究以好氧顆粒污泥為生物載體、小球藻與柵藻為接種微藻,開展了菌藻耦合顆粒化系統構建與解析工作,并考察了選擇壓關鍵因子—沉降時間的作用影響.研究結果指出好氧污泥與微藻可形成穩定的耦合顆粒體,沉降時間會影響耦合進度,但其并非耦合實現的決定性因素.在穩態顆粒性質方面,沉降時間差異設定會顯著影響耦合顆粒的沉降性能、氮素去除能力、粒徑大小及生物柴油產量(P＜0.05),但耦合顆粒的微生物表面電荷、關鍵脂肪酸甲酯組分及磷素去除能力對其作用響應并不顯著(P＞0.05).藍藻和真核藻類在顆粒中所占比例約為5%和 95%,接種微藻在真核藻類群落中可保持主導地位(相對豐度＞98%),但不同沉降時間處置下小球藻和柵藻在顆粒體中相對優勢性具有明顯區別.

廢水處理；生物質能源；菌藻共生；顆粒污泥；沉降時間

細菌與藻類對維持水環境中的物質循環與生態平衡具有重要作用,同時也被認為是替代石化能源的重要生物質原料[1-2].近年來,好氧顆粒污泥技術成為活性污泥工藝領域的研究熱點與發展方向,以沉降時間為代表的選擇壓被認為在其啟動過程中發揮著主導作用[3],而文獻報道指出顆粒化結構中不單包括細菌和真菌等微生物,還可在有光條件下為藻類提供共生環境[4-5].因此,上述發現表明好氧顆粒污泥與功能性微藻具有耦合共生的可能性,在有效處理廢水的同時,有望提高剩余污泥資源化價值與微藻回收效率.但是,目前針對該耦合顆粒體的培養過程調控及性質認定等還有待研究.基于此現狀,本研究開展了此新型菌藻共生系統構建與解析工作,并考察了該系統對沉降時間的作用響應情況,以期為微生物顆粒技術體系進一步完善提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 接種微藻與顆粒污泥

實驗微藻為小球藻(FACHB-31)和柵藻(FACHB-416),兩者均采購于中國科學院水生生物研究所,微藻接種前采用 BG11培養基進行擴大培養,反應器中微藻的接種量約為 107cell/L.實驗接種好氧顆粒污泥的懸浮濃度約為 2g/L,顆粒平均粒徑為(0.63±0.04)mm.

1.2 運行條件設置

實驗采用運行裝置為 3組玻璃制成的序批式光照反應器,反應器有效體積為 2L,體積交換率設定為 75%.反應器設置在光照培養箱中進行操作,光照設置模擬日光條件(即 12h光周期),光照強度設定為(6000±200)lux,溫度為(26±1)℃,富氧采用底端曝氣方式,氣量通過流量計控制在2L/min,pH值水平保持在7.2～7.7之間.廢水處理運行設定在有光周期內進行,每日運行2周期,每周期6h,其中進水時間1min,排水時間2min,沉降時間分別為 2min(R1)、5min(R2)和 10min(R3),剩余周期內時間為曝氣階段.實驗廢水為自來水配制而成的模擬城市污水,水質主要成分及其平均含量為:生化需氧量(200mg/L)、氨氮(35mg/L)、磷酸鹽(10mg/L)和碳酸氫鈉(400mg/L).

1.3 分析項目和方法

實驗中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮、磷酸鹽及污泥體積指數等按照國家相關標準方法進行分析測定[6].耦合顆粒中藻類的富集程度通過葉綠素含量進行表征,顆粒測定前首先利用超純水輕微清洗 3次,以降低懸浮吸附態藻類對分析的干擾,之后通過乙醇法提取葉綠素,葉綠素含量測定按照 Ritchie[7]所述方法進行操作,并以生物干重計量.顆粒經分散處理后,穩態耦合顆粒所含藍藻比例與細胞表面電荷水平,分別通過PHYTO-PAM 浮游植物熒光儀(Heinz Walz, Effeltrich)和Zeta電位分析儀(MALVERN, ZEN 3600)進行測定.穩態菌藻耦合顆粒的平均粒徑大小通過激光粒度儀(Malvern Mastersizer 2000)分析測定.實驗采用 SPSS軟件進行菌藻耦合顆粒性質差異顯著性的統計分析(P＜0.05).

成熟耦合顆粒經冷凍干燥后用于后續資源化研究,生物質脂肪酸甲酯(FAMEs)制備采用原位酯交換反應方法[8],通過氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890A - 5975C)進行 FAMEs組分分析,FAMEs標準樣品為 52種 C4～C24混合標樣(GLC-674, Nu Chek Prep. Inc).色譜柱為安捷倫HP-5MS毛細管柱 (30m×250μm×0.25μm),色譜升溫程序設定為:50℃恒溫 2min;之后以 10℃/min升溫速率提高到250℃,并保持20min.載氣為高純氮氣,分流比為20:1,離子源溫度保持200℃,掃描質量數范圍為50～500amu.在耦合顆粒化系統穩定階段(第40d),實驗對其結構中真核藻類群落進行分析,DNA和PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測,引物對應區域為 18sV4區(528F-706R),使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建文庫經 Qubit和 QPCR定量后,使用Illumina? HiSeq 2500平臺進行高通量測序,之后測序數據經過拆分、拼接及過濾后,利用 Uparse軟件對有效Tags進行聚類(默認值為97%),采用RDP Classifier方法與Silva數據庫進行物種注釋分析.

2 結果與討論

2.1 菌藻耦合顆粒化的培養進程

藻類處理廢水的研究過程中,葉綠素含量被普遍用于衡量其在系統中的生物量水平[9],因此,本研究以此指標對菌藻耦合進度與效果進行評估.實驗結果指出在短暫耦合運行后,葉綠素在顆粒體中即可被顯著檢出[約為(0.1±0.03)mg/gSS],而在運行后期,不同耦合顆粒中葉綠素含量均顯示出相對穩定的趨勢[約為(5.27±0.17)mg/gSS].此結果表明藻類與好氧顆粒污泥可實現良好的耦合共生效果,但藻類在顆粒體結構中存在富集的平衡點,進而我們認為此平衡狀態可作為確定該系統啟動是否達到穩定階段的假設依據.如圖1所示,R1系統中顆粒所含葉綠素水平在第30d達到穩態,而R2和R3系統則發生在第25d,根據上述假設,此變化趨勢指出沉降時間不是菌藻耦合顆粒形成的決定性因素,但較長的沉降時間有利于加快耦合顆粒培養進程.該規律與沉降時間對好氧污泥顆粒化過程的影響效果相反[3],歸結原因是由于藻類的沉降速率較慢及成熟顆粒污泥的應用,較短沉降時間設定條件會降低接種微藻與好氧顆粒污泥耦合共生的生物量,從而延遲了耦合顆粒化系統的啟動時長.

圖1 耦合顆粒中葉綠素含量及組分比例的變化情況Fig.1 Change in concentrations and compositions of chlorophyll in algae-bacteria granular consortia

葉綠素a和葉綠素b為本實驗所接種微藻的主要葉綠素構成組分[7],實驗結果表明隨著顆粒化進程,兩者的含量比例也會發生顯著上升.在初期階段顆粒體中葉綠素a與葉綠素b的比例約為(0.65±0.01),而在穩態階段R1～R3中平均比例分別為(3.38±0.06)、(3.25±0.09)和(3.22±0.07).關于葉綠素循環的綜述文獻報道指出植物從光照條件轉變到避光條件后,由于光系統核心復合體應激調控,其葉綠素a與葉綠素b的比例會發生顯著升高[10].因此,耦合顆粒體中葉綠素組分比例變化結果暗示隨著藻類在顆粒體中富集含量增加,顆粒內層結構光供給不足現象將會發生,而在較短沉降時間設定條件下此現象將較為顯著.

2.2 穩態菌藻耦合顆粒的物化性質

菌藻耦合顆粒達到穩態階段后,實驗對耦合顆粒性質進行了檢測分析,各測定參數數據的平均值如表1和圖2所示.實驗結果指出耦合顆粒粒徑大小及可表征微生物聚集體沉降性能的5min污泥體積指數(SVI5)在3組反應器中差異顯著(P＜0.05),而較弱選擇壓導致的絮狀生物體和細小顆粒在反應器中累積存留為引發此現象的主要原因[3],該結果表明較長沉降時間會影響耦合系統的顆粒化效果.Qin等[11]在研究沉降時間對好氧污泥顆粒化的作用中也發現,較長沉降時間下顆粒生長緩慢,并且粒徑較小.然而,Zeta電位檢測數據指出不同耦合顆粒的微生物表面電荷并未表現出顯著差異(P＞0.05),即耦合體中微生物細胞間的靜電斥力保持相似水平[12],從而表明沉降時間差異設定不會影響耦合體的聚集穩定性.

在生物質能源制備方面,實驗結果指出在較短沉降時間設定條件下耦合顆粒的FAMEs產量會顯著降低(P＜0.05),而本實驗中R1系統較大的顆粒粒徑對于顆粒內部光通量限制的增強,可能是導致其FAMEs較低產出的因素之一.周文廣[13]等指出光照是藻類進行光合固碳的先決條件,而當其成為藻類培養過程的限制因素時,藻類固碳率與光轉化效率成正比.盡管 FAMEs的產量有所差異,但是其主要構成組分的含量比例在不同選擇壓強度下具有相似性.不同 FAMEs產品中不飽和脂肪酸甲酯(52%～56%)所占比例皆略高于飽和脂肪酸甲酯(44%～48%);而棕櫚酸甲酯(C16:0)為應用不同耦合顆粒制備的生物柴油的主要組成成分,其含量比例為24.79%～26.16%.通常,pH值、溫度及氣體傳質等眾多因素可影響藻類體內中性與極性脂質含量,還可影響細菌及真菌中脂肪酸成分形態[13-14].但棕櫚酸甲酯被普遍發現是以活性污泥或藻類為原料制備的生物質柴油的主要成分[1,9,15-16],而飽和或不飽和FAMEs在生物柴油中所占比例與其制備方法具有緊密的相關性[17],因此微生物中主要脂肪酸成分的相似性及相同 FAMEs制備方法的應用,可能是本實驗中FAMEs組分差異不大的主要原因.

表1 穩態菌藻耦合顆粒的性質參數Table 1 Characteristics of algae-bacteria granular consortia in the mature phase

圖2 耦合顆粒的FAMEs組分(相對比例含量＞2%)Fig.2 Composition of FAMEs (relative proportion ＞ 2%) obtained from the different granular samples

2.3 菌藻耦合系統的水質凈化效果

穩態菌藻耦合顆粒在不同選擇壓運行條件下的營養鹽去除能力如圖3所示.實驗結果指出R1～R3中氨氮平均比降解速率分別為9.80、9.49和 9.44mg/gSS,而總氮平均比降解速率分別為3.80、3.75和 3.51mg/gSS,耦合顆粒系統單一周期內的氮素比降解速率在2min和10min沉降時間設定條件下差異顯著(P＜0.05),較短沉降時間設定條件下的反應器展現出較高的氨氮降解能力和總氮去除能力.Gao等[18]綜述指出粒徑可成為顆粒結構內部溶解氧傳導與基質擴散的主要限制因素,并決定好氧顆粒污泥的氮素硝化與反硝化作用區域面積,從而影響氮素去除效果.結合顆粒的性質分析結果,系統中氨氮去除情況不符合顆粒粒徑大小對顆粒污泥的影響規律,分析原因有兩點:(1)藻類的氮素生物吸收累積作用可使污泥系統內氨氮轉化途徑多元化[9,19],從而降低顆粒粒徑對氨氧化過程的影響程度;(2)光照條件會顯著抑制氨氧化菌和硝化細菌的生物活性[20],而 R1中耦合顆粒因具有較大粒徑,可為其結構中脫氮細菌起到保護作用,從而提高氨氮降解效果.此外,Liu等[21]指出藻類在固定二氧化碳過程中所產生的有機代謝產物,可成為菌藻共生體系內反硝化異養菌的有效碳源,因此耦合顆粒中藻類分泌物可能是R1在具有較大反硝化區域基礎上,另一個促進其總氮去除的影響因素.

圖3 氮磷營養鹽的周期比降解速率Fig.3 Specific removal rates in one cycle of ammonia nitrogen, total nitrogen and phosphate

在磷酸鹽去除能力方面,R1～R3系統的平均比去除速率分別為1.16、1.17和1.17mg/gSS,沉降時間差異設定對耦合系統除磷效果的影響并不顯著(P＞0.05).盡管,生物吸收利用與化學沉淀皆為微生物系統中磷酸鹽的去除途徑,但是在pH＜9條件下前者已被證明是絮狀菌藻共生體系處理污水過程中磷酸鹽的主導脫除方式,而細菌與藻類對磷酸鹽的最大吸收能力分別取決于水質中碳磷比例和氮磷比例[22],因此本實驗所用模擬城市污水的有機物與營養鹽組分決定了不同耦合顆粒對磷酸鹽去除的相似性.

2.4 穩態顆粒的藻類群落結構

好氧污泥與微藻耦合顆粒達到穩態階段后,對其藻類構成進行檢測分析,群落組成信息如表1和圖 4所示.實驗結果指出以藍藻為代表的原核藻類在耦合顆粒中是普遍存在的,但其在藻類群落結構中所占相對豐度較低(約為 4%～5%),而沉降時間差異控制未對其富集比例具有顯著影響(P＞0.05).眾多相關研究也發現類似藻類競爭規律,文獻報道指出在光照不足條件下,柵藻比藍藻具有更快的氮素吸收利用速率,而小球藻會取代藍藻成為光合微生物群落結構中優勢物種[23].此外,Ramanan等[19]發現相比藍藻,變形菌門和擬桿菌門更易于與綠藻形成共生關系,而此兩種細菌群落已被證明在好氧顆粒污泥結構中占據主導地位[5,24].

微生物高通量測序分析結果指出實驗所用的接種微藻可保持其在真核藻類結構中顯著的優勢地位,兩者在不同耦合顆粒中所占相對豐度總和皆大于 98%.耦合顆粒中共生的其他藻類主要包括硅藻綱(Bacillariophyceae)所屬的羽紋藻(Pinnularia)、細柱藻(Cylindrotheca)和繭形藻(Entomoneis),共球藻綱(Trebouxiophyceae)所屬的索囊藻(Choricystis),及綠藻綱(Chlorophyceae)所屬的環藻(Sphaeroplea).同時,測序分析結果也顯示選擇壓差異控制可影響小球藻與柵藻在耦合顆粒中的相對豐度水平,在2min沉降時間條件下柵藻所占比例較高(約為 54%),而較長沉降時間設定條件下小球藻則具有顯著優勢(相對豐度約為80%).不同微藻與浮游動物間的相互作用關系可能與此現象相關.文獻報道及本課題組前期研究證明好氧顆粒污泥結構及系統體系中存在原生動物共生現象[25],而小球藻和柵藻分別會以提高增長率和群體聚集方式來應對原生動物的攝食風險[26],從而在較弱選擇壓下小球藻具有富集優勢,而在較強選擇壓下柵藻的群體效應則促使其與顆粒污泥形成更為穩定的共生關系.

圖4 穩態耦合顆粒的真核藻類群落結構Fig.4 Taxonomic affiliation of eukaryotic algae in steady-state granular consortia

3 結論

3.1 廢水處理過程中好氧顆粒污泥與典型功能性微藻,可在序批式光照反應器中形成穩定的耦合顆粒化共生體;藻類在顆粒體結構中存在富集的生物量平衡點,并會遇到光能供給不足的限制影響;接種微藻可在顆粒體藻類結構中保持顯著的優勢地位,而藍藻相對豐度較低.

3.2 沉降時間在耦合顆粒形成過程中不起決定性作用,但其差異設定會顯著影響穩態耦合顆粒的部分性質;盡管較長沉降時間設定可加快菌藻耦合進程與提高生物能源產量,但會降低系統的顆粒化效果與氮素營養鹽去除能力;此外,高通量測序結果暗示耦合顆粒中微藻的種群優勢性可實現定向調控,而沉降時間可作為備選控制條件.

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Research on the development and properties of aerobic sludge-microalgae granular system.

LIU Lin1,2*, YE Jia-qi1, LIU Yu-hong1,2, HUANG Xu1, LIU Chao-xiang1*(1.Key Laboratory of Urban Pollutant Conversion, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China；2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2536～2541

The effect of settling time on the development and properties of algae-bacteria granular consortia, which were cultivated with aerobic granules as biological carrier, and Chlorella and Scenedesmus as seed microalgae, were investigated in this research. The results indicated that the algae-bacteria granular consortia could be successfully developed based on the aerobic granules and targeted microalgae. Although settling time could affect the start-up duration of granular system, it was not the crucial factor for the culture of granular consortia. In terms of properties of the mature granular consortia, the settling time could significantly affect the settleability, nitrogen removal ability, granular size and biodiesel yield of the consortia granules (P＜0.05), while the obvious response of zeta potential, phosphate removal rate and the dominate compositions of fatty acid methyl esters in the biodiesel to the settling time was not observed in this experiment (P＞0.05). The relative abundance of cyanobacteria and eukaryotic algae in all granules were about 5% and 95%, respectively. The targeted microalgae maintained dominance in the eukaryotic algal community (relative abundance＞98%), and the comparative advantage of biomass between Chlorella and Scenedesmus in the granules was showed under the different condition of settling time in systems.

wastewater treatment；biomass energy；algal-bacterial consortia；granular sludge；settling time

X703.1

A

1000-6923(2017)07-2536-06

劉 琳(1984-),男,黑龍江七臺河人,助理研究員,碩士,主要從事廢水處理與資源化技術研究.發表論文50余篇.

2016-12-06

國家自然科學基金資助項目(51308523);廈門市科技計劃項目(3502Z20162001);廈門理工學院創新項目(201611062288)

* 責任作者, 助理研究員, lliu@iue.ac.cn; 研究員, cxliu@iue.ac.cn