鐘文玨,張 瑜,祝凌燕(南開大學環境科學與工程學院,天津城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,教育部環境污染過程與基準重點實驗室,天津 300350)
沉積物中芘對淡水底棲動物的急慢性毒性效應
鐘文玨,張 瑜,祝凌燕*(南開大學環境科學與工程學院,天津城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,教育部環境污染過程與基準重點實驗室,天津 300350)
研究了沉積物中芘對淡水底棲動物花翅羽搖蚊幼蟲和淡水單孔蚓的急慢性毒性效應.芘對花翅羽搖蚊幼蟲96h及14d的半數致死濃度(LC50)分別為189mg/kg干重和83.6mg/kg干重,28d羽化半數抑制濃度(EC50)為26.1mg/kg干重.沉積物中芘對花翅羽搖蚊幼蟲的羽化時間具有延滯作用,但是對雌雄個體羽化時間的延滯作用沒有顯著的差異.淡水單孔蚓對芘的耐受力較搖蚊幼蟲強.芘對淡水單孔蚓體表損傷(包括尾部發白、尾部凹陷及自斷)的14d及21d EC50分別為222mg/kg干重和106mg/kg干重,21d生長抑制的EC50為81.7mg/kg干重.比較國外已有的芘沉積物質量基準值和本文的初步評估結果發現,國外的芘沉積物質量基準值并不適合我國所用,需要更全面的沉積物中芘對底棲生物的毒性數據來對我國的芘淡水沉積物質量基準值進行推導.本研究結果對推導芘的沉積物質量基準和進行沉積物生態風險評價提供幫助.
芘;毒性效應;底棲生物;沉積物
沉積物是淡水生態系統的重要組成部分,對水環境生態功能發揮起著重要的作用.它一方面能為淡水底棲生物提供生活場所和營養物質[1],另一方面它又是很多疏水有機污染物的貯藏庫和最終環境歸宿[2-4].當污染物在沉積物中累積到一定程度時,就會對生活于其中的底棲生物構成直接威脅,甚至可能會通過污染物在食物鏈中的傳遞和生物放大行為而間接的威脅人類健康.因此,研究淡水沉積物中有毒物質對底棲生物的生態毒性效應具有重要的理論意義和現實意義,同時對沉積物質量基準的建立和環境風險評價具有重要的意義.
芘是一種被懷疑具有致癌性的四環多環芳烴,是美國環境保護署(USEPA)提出的需優先控制的16種多環芳烴之一.它具有較高的辛醇-水分配系數及較低的水溶性,在水環境當中它更容易蓄積吸附在沉積物中.日本Doki灣、美國南卡羅來納州、波斯灣Hormuz海峽等地的沉積物中均有芘的檢出[5-7].我國的淡水沉積物中芘也是普遍存在的[8-12].與國外沉積物中芘的殘留量相比,我國淡水沉積物中芘的殘留量屬于中等水平.值得注意的是,雖然我國沉積物中芘殘留水平并不高,但是與芘的各類沉積物質量基準值相比(表1),仍然有很多地方的殘留量超過了芘的沉積物質量基準低值,有的甚至超過了基準高值.如果以Macdonald等[13]推算出的閾值效應水平(TEL)作為評判標準,上文提及的千島湖、巢湖、京杭運河杭州段、遼河流域沉積物中的芘均有超標現象存在,而太湖梅梁灣地區更是 100%超標.這說明,我國淡水沉積物中的芘殘留還是有可能帶來一定的生態風險的.因此,需要對沉積物中芘可能帶來的危害加以重視.
另一方面,目前報道的芘沉積物質量基準均是國外環保部門或者學者推算的,這些基準值的獲取都是以國外的生態環境及物種的毒性數據為基礎建立的.各個國家的水環境條件、廣泛分布的底棲生物物種的情況各有不同,美國、加拿大、英國等國家都根據自己的情況提出了適合本國的芘沉積物質量基準值,而且各不相同,可見直接用國外的基準值評價我國的淡水沉積物質量是不合理的.因此,有必要用我國的毒性數據來對我國的芘淡水沉積物質量基準進行推導.目前我國關于芘毒性效應的研究并不少見,但是絕大部分的研究都是針對各種魚類進行的,即使是針對底棲生物進行的實驗也都是對上覆水進行染毒,獲得的毒性數據的單位多為 mg/L或者 μg/L,這些數據并不能用于推導沉積物質量基準.目前可用于推導芘沉積物質量基準的毒性數據非常缺乏,亟待補充.因此,本文針對沉積物中芘對淡水底棲生物急慢性毒性開展研究,為淡水沉積物質量基準制定和進行沉積物生態風險評價提供基礎數據.

表1 芘的各類沉積物質量基準值匯總(mg/kg干重)Table 1 Sediment quality guidelines for pyrene in freshwater ecosystems (mg/kg dw)
1.1 儀器與試劑
芘標準溶液、甲醇、正己烷、乙腈、丙酮、二氯甲烷(均為色譜純級別)均購自百靈威科技有限公司.
氮吹儀(天津恒奧科技),冷凍干燥機 FD-1A-50(北京博醫康),高速離心機 TDL-5-A(上海安亭),電子天平FA2104N(上海精科),pH計(上海精科),組織搗碎機 DS-1(上海精科),恒溫振蕩器 THZ-C(太倉市實驗設備廠),超聲波清洗儀KQ5200E(昆山超生),高效液相色譜儀 1260(安捷倫科技).
1.2 沉積物染毒
采用Pasteris等[22]推薦的方法,采集天津周邊地區自然保護區內相對潔凈的沉積物進行加標染毒.沉積物經自然風干后,過40目篩去除粗顆粒,室溫保存.潔凈沉積物中未檢出芘,其它理化性質如下:PH值 7.67;有機質含量 4.11%;陽離子交換量38.47cmol(+)·kg-1;含水率1.03%;機械組成為64%的粉砂、12%的沙子和24%的黏土.
將溶于丙酮的芘儲備液加到少許潔凈沉積物中,機械混勻 10min,然后將染毒沉積物放置在黑暗處揮發 48h.將剩余沉積物分多次逐步加入到染毒的沉積物中混勻,重復此過程直至所有的沉積物都混勻,沉積物總量為50g干重.混勻后加入200mL曝氣水攪拌,沉積物和上覆水的比例為1:4,室溫下避光平衡 14d,使泥水達到平衡.平衡后,測定沉積物中芘的實際濃度(方法回收率為92%~98%).暴露濃度的設置是根據預實驗的結果,首先得出完全不受影響和 100%受影響的兩種極端濃度,然后在兩個極端濃度之間,圍繞大致的半數效應濃度周圍設置.芘對底棲生物急性、亞慢性和慢性毒性的實際染毒濃度如表 2所示.每組實驗的每個濃度均設置 6個平行,同時設置試劑空白組(沉積物中加入與儲備液體積相同的丙酮溶劑及等量曝氣水)和空白對照組(沉積物中只加入等量曝氣水).

表2 沉積物中芘的實際加標濃度(mg/kg 干重)Table 2 The acutal concentrations of Pyrene in sediment (mg/kg dw)
1.3 受試生物及毒性試驗
花翅羽搖蚊幼蟲,屬于搖蚊科、雙翅目長角亞目.搖蚊科的幼蟲生物量約占底棲生物量的70%~80%,是種類多、分布廣、生物量大的淡水底棲動物類群之[23].同時搖蚊幼蟲也是美國環保局 USEPA和歐盟推薦的生物毒性測試物種[24].淡水單孔蚓,屬單孔蚓屬,顫蚓科,是淡水底棲動物常見物,在我國廣泛分布于陜西、長江、江蘇、浙江、江西、湖北等地,對環境有較強的適應能力,既是水生食物鏈的重要一環,也是重要的水質等級指示生物,對沉積物污染具有良好的指示作用[25-26].因此本文選取花翅羽搖蚊幼蟲和淡水單孔蚓為受試生物.
搖蚊幼蟲實驗選用卵孵化后10d左右、體長約為0.5cm的二齡搖蚊幼蟲,根據美國EPA的底棲生物標準實驗方法[27-28],進行96h、10d及28d搖蚊幼蟲毒性試驗.對于96h和10d實驗,實驗期間每天觀察記錄幼蟲行為及形態變化,實驗結束后過篩,記錄存活數、個體體重及羽化個體,失蹤個體計為死亡數.對于28d實驗,一周后將燒杯口用紗布罩住,每天定期觀察,記錄搖蚊幼蟲活動行為、死亡和羽化情況,死亡搖蚊個體算作未羽化個體.當有羽化蚊子出現時,將蚊子移出并分辨其性別.28d實驗結束后,記錄存活幼蟲數量,并計算其存活率、羽化率、20%羽化時間(EMt20)和50%羽化時間(EMt50).
淡水單孔蚓實驗選用 5cm左右、健康敏捷且大小一致的淡水單孔蚓進行暴露實驗.實驗前先將淡水單孔蚓置于盛有曝氣清水的燒杯中,進行清腸處理.清腸24h后選用仍然健康的淡水單孔蚓用于后續生物測試階段.結合 Lydy實驗方法[29],進行14d 和21d毒性試驗,實驗期間每天觀察記錄幼蟲行為及形態變化,實驗結束后過篩,記錄存活數、個體體重、體表損傷情況等,其中失蹤個體計為死亡數.
實驗過程中保證溫度、pH、上覆水硬度等參數以及喂食次數與馴養期間環境條件一致,試劑空白與空白對照組的平均存活率均大于 80%.兩種受試生物的馴養條件參見文獻[30].
1.4 芘的分析檢測方法
沉積物樣品冷凍干燥24h后,取1g于50mL離心管中,加入30mL甲醇,將離心管在搖床上振蕩30min,超聲萃取1h,然后以10000r/min轉速下高速離心 20min,過膜待測.樣品分析在配有熒光檢測器的高效液相色譜儀(安捷倫,HPLC, 1206)上進行,色譜柱為 C-18.流動相為:H2O (10%)+CH3OH(90%);激發波長:250nm,發射波長:400nm;流速:1mL/min;進樣量:7.5μL.外標法進行定量分析.
1.5 統計分析
試驗結果半數致死濃度(LC50)及半數效應濃度(EC50)均采用SPSS19統計軟件的概率回歸法計算得出,運用Origin軟件作圖.
2.1 芘對花翅羽搖蚊幼蟲的毒性效應
2.1.1 芘對花翅羽搖蚊幼蟲的急性和亞慢性毒性效應 對于96h急性毒性試驗,搖蚊幼蟲死亡率隨暴露濃度的增加而增加,并呈現較好的相關性(圖1A,R2=0.97).當芘暴露濃度從42.5mg/kg上升到360.4mg/kg時,花翅羽搖蚊幼蟲的死亡率從20%上升到 100%.觀察發現:高濃度芘使沉積物中搖蚊幼蟲產生劇烈反應,身軀呈“C”字型棲息在水體-沉積物界面處,并且不停的翻動,顯示出對生存環境的極大抗拒.96h后沉積物表面開始出現僵硬的對機械刺激毫無反應的搖蚊幼蟲軀體,死亡的搖蚊個體一般會在死亡 48h內發生解體自溶現象.未解體死亡個體的軀體由紅慢慢變白,體表未發現肉眼可見損傷.
對于 10d亞慢性毒性實驗,當搖蚊幼蟲暴露于較高濃度組(126mg/kg)時,在第6d開始在沉積物表層發現死亡搖蚊幼蟲個體.隨后各個濃度組水體-沉積物界面層陸續開始出現死亡個體.比較圖1A和圖1B可見,芘對花翅羽搖蚊幼蟲的毒性作用會隨著暴露時間的延長及暴露濃度的增加而增強(圖1B,R2=0.89).
用概率回歸法計算芘對花翅羽搖蚊幼蟲的96h和10d LC50及95%置信區間(C.I.)如表3所示.
2.1.2 芘對花翅羽搖蚊幼蟲的慢性毒性效應 在研究芘對花翅羽搖蚊幼蟲慢性毒性作用的 28d暴露試驗中,對存活率、羽化率和羽化時間進行了觀測.空白對照及溶劑對照組的平均羽化率均在14d內到達了100%,說明背景污染及溶劑效應對花翅羽搖蚊幼蟲的羽化率沒有顯著性影響,實驗結果符合毒性試驗標準.花翅羽搖蚊幼蟲的存活率、羽化率、EMt50和EMt20的結果如表 4所示.結果顯示,當暴露濃度達到 38.4mg/kg時,花翅羽搖蚊幼蟲的存活率略有下降,說明暴露濃度范圍內沉積物中的芘對花翅羽搖蚊幼蟲的存活沒有明顯影響.對于羽化率則呈現羽化率隨著沉積物中芘濃度的升高而顯著降低的現象(圖2).根據存活率和羽化率結果,利用概率回歸法獲得芘對花翅羽搖蚊幼蟲的28d羽化抑制EC50為26.1mg/kg.

圖1 芘對花翅羽搖蚊幼蟲96h和10d毒性試驗結果Fig.1 The toxic effect of Pyrene to Chironomuskiiensis in 96h-test and 10d-test Chironomuskiiensis

表3 芘對花翅羽搖蚊幼蟲的96h和10d LC50及95%置信區間(mg/kg 干重)Table 3 The LC50and 95% confidence interval of Pyrene to Chironomuskiiensis in 96h d-test and 10d-test (mg/kg dw)

表4 28d試驗中芘對搖蚊存活率和羽化時間的影響Table 4 The survival rate and emergence time of Chironomuskiiensisin 28d-test

圖2 28d暴露過程中搖蚊存活率及羽化率隨芘濃度變化情況Fig.2 The survival rate and emergence rate of Chironomuskiiensis in 28d-test

圖3 28d暴露過程中花翅羽搖蚊幼蟲EMt20和EMt50隨芘濃度的變化Fig.3 The EMt20and EMt50of Chironomuskiiensis in28d-test
不同濃度芘對搖蚊羽化時間的影響見圖 3.試劑空白組、9.6、20和29.8mg/kg濃度組搖蚊的EMt50分別為16、19、21和23d;試劑空白組、9.6、20、29.8和38.4mg/kg濃度組搖蚊的EMt20分別為12、15、19、20和21d.由此可見,盡管對照組和低濃度組的 3個試驗組中搖蚊的羽化率均達到甚至大于 50%,但芘還是在一定程度上抑制了搖蚊幼蟲的羽化,使羽化時間有了不同程度的延滯,EMt20也顯示了類似的規律.在記錄羽化時間和羽化率的同時,還記錄了芘對羽化花翅羽搖蚊性別比的影響.結果發現對照組及實驗組羽化的搖蚊個體性別比例幾乎為 1:1,同時雌性和雄性個體的羽化時間無明顯差異.說明芘會在一定程度上延長搖蚊的羽化時間,但對雌性和雄性搖蚊幼蟲的影響無明顯差異.
2.2 芘對淡水單孔蚓的毒性效應
研究結果顯示芘對淡水單孔蚓的毒性作用較弱,當芘的濃度高達591.2mg/kg時,21d暴露的致死率僅為 20%,說明芘對淡水單孔蚓的致死效應比較弱.而真實的水體-沉積物環境中的芘污染往往達不到如此高的濃度,說明淡水沉積物中的芘對水絲蚓致死威脅較小.盡管芘不足以使淡水單孔蚓大量死亡,但是隨著芘濃度的增加及暴露時間的延長,淡水單孔蚓個體會顯示出不同程度的中毒癥狀.這些癥狀有些發生在尾部斷裂,有些發生在頭部變形,主要包括尾部自斷、尾部僵化失去伸縮能力、尾部僵化分解、頭部僵硬、頭部腫脹等.實驗過程中記錄淡水單孔蚓的損傷情況,計算損傷率.實驗過程中,受試生物共出現尾部發白、尾部凹陷和尾部自斷 3種體表損傷.結果顯示,隨著沉積物中芘濃度的升高,產生個體損傷癥狀的淡水單孔蚓的數量具有上升趨勢(圖4).利用概率單位法計算得到的芘對淡水單孔蚓的14d及21d個體損傷效應的EC50見表5.

表5 芘對淡水單孔蚓的EC50值及95%置信區間(mg/kg干重)Table 5 The EC50and 95% confidence interval of Pyrene to Monopylephoruslimosusin 14d-test and 21d-test (mg/kg dw)

圖4 14d及21d暴露實驗中芘對淡水單孔蚓的損傷率Fig.4 The body-surface trauma rate of pyrene on Monopylephorus limosus in 14d and 21d-test
本研究在淡水單孔蚓慢性毒性試驗中記錄了暴露過程中淡水單孔蚓的存活情況及生長受抑制情況.從圖 5A可以看出,芘對淡水單孔蚓的致死效應較弱.當暴露濃度低于 591.2mg/kg時,淡水單孔蚓都能夠 100%存活.591.2mg/kg濃度組暴露14d后的存活率下降了10%;暴露時間延長到21d后,存活率下降20%,這說明隨著暴露時間的延長,芘對淡水單孔蚓的毒性作用會有一定程度的增加.雖然芘對淡水單孔蚓的致死毒性效應較弱,但卻可以不同程度的影響其生長發育,而且隨著暴露濃度的增加而增強(圖 5B).當芘濃度達到301.2mg/kg時,對淡水單孔蚓的生長抑制率達80%.芘對淡水單孔蚓生長抑制效應的EC50為81.7mg/kg.

圖5 毒性暴露中淡水單孔蚓的存活率和生長抑制率隨芘濃度變化情況Fig.5 Survival rate and growth rate of Monopylephorus limosus
2.3 本研究毒性值與現有芘沉積物質量基準的比較分析
表 1中已列出目前現有的芘沉積物質量基準值.將本研究的毒性數據與現有基準值相比,可以看出本研究的毒性數據均高于現有基準的最高值.表 1中列出的基準值大部分是建立在生物效應數據基礎上.生物效應數據法基準值的推導中所用的數據要結合本國家或地區的物種分布情況及實際數據可獲得情況進行選擇,其中既包含敏感生物的數據,也包括耐受性高的生物的毒性數據,需要將毒性數據排序,然后獲得可保護一定比例生物的基準高值和基準低值.這些數據中必然有部分數據高于基準值,而搖蚊幼蟲和水絲蚓本身屬于對芘的耐受能力較高的物種,所以其毒性效應值高于基準值也是合理的.另外,表1中列出的部分基準值的推導數據中包含了一部分根據水質基準用相平衡法推導而來的數據以及用其他方法推導出的芘的基準值,這些數據與實際沉積物暴露所獲得的毒性效應數據相比往往處于較低水平,如果這類數據的數量較多,則有可能導致推導的沉積物基準值偏低.所以,綜上所述,推測本研究的毒性數據遠高于目前現有的基準值的原因可能與搖蚊幼蟲和水絲蚓具有很強的耐污性以及推導基準時的數據選擇有關.
表 6列出了我國多個地區沉積物中芘的殘留量,將表 6中各區域沉積物中芘含量與本研究獲得毒性數據和現有的基準值相比發現,雖然有部分地區的芘含量已經超過了基準,但是對于花翅羽搖蚊幼蟲和淡水單孔蚓兩種底棲生物暫時是安全的.搖蚊幼蟲和水絲蚓是我國淡水沉積物中分布廣、生物量大的物種,是我國淡水底棲生物的重要組成部分.這一結果表明,在對我國沉積物中芘的生態風險進行評估時,直接套用國外的基準可能存在過嚴格的現象.根據目前的結果,還不能絕對的認為國外的現有基準是否適合我國.還需要更多的相關毒性數據的支撐,來獲得適合我國的芘淡水沉積物質量基準值,為更準確的評估我國淡水沉積物質量提供幫助.而目前的毒性數據還非常缺乏,亟待大量補充.本文研究結果可為推導芘沉積物質量基準和進行沉積物生態風險評價提供依據,為全面保護水環境質量提供數據支撐.在未來的研究中,還需要對我國的淡水環境沉積物中的物種分布進行調查,對更多種類的底棲生物進行馴養,對其進行沉積物暴露實驗,獲得更多的急慢性毒性數據,以用于推導更為適合我國的芘的沉積物質量基準.

表6 我國各地區沉積物中芘含量(mg/kg 干重)Table 6 The concentrations of Pyrene in sediment in China (mg/kg dw)
以淡水底棲生物花翅羽搖蚊幼蟲和淡水單孔蚓為研究對象,研究了沉積物中芘對底棲生物的急慢性毒性效應,分別計算了芘對花翅羽搖蚊幼蟲的96h和10d的LC50、28d羽化抑制效應的EC50,以及芘對淡水單孔蚓14d和21d的體表損傷EC50及21d生長抑制效應的EC50.比較芘對兩種生物的毒性發現,淡水單孔蚓對芘的耐受力較搖蚊幼蟲強.本研究的毒性值均高于現有的芘沉積物質量基準值,這可能與搖蚊幼蟲和水絲蚓的耐污性,以及現有基準可能選擇了較為敏感的物種的數據有關.將我國各區域沉積物中芘的含量與本研究的毒性值和現有基準比較發現,直接照搬國外的基準值來評估我國的沉積物質量是不合理的,需要根據我國本土生物的毒性試驗數據建立適合我國的基準值.
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Acute and chronic toxic effects of pyrene on the benthic organisms in sediments.
ZHONG Wen-jue, ZHANG Yu, ZHU Ling-yan*(Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria of Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering of Nankai University, Tianjin 300350, China). China Environmental Science, 2017,37(7):2765~2772
Acute and chronic toxic effects of pyrene on Chironomus kiiensis and Monopylephorus limosus in sediment were studied in this paper. For Chironomus kiiensis, the median lethal concentrations (LC50) in 96h and 14d tests were 189mg/kg dw and 83.6mg/kg dw, and the median effect concentration (EC50) of emergence in 28d test was 26.1mg/kg dw. Pyrene could delay the emergence time of Chironomus kiiensis, while there are no significant difference in emergence time between male and female. Compared with Chironomus kiiensis, pyrene displayed lower toxicity to Monopylephorus limosus. The EC50of body-surface trauma (including white rear, depressed rear and autotomy) of pyrene on Monopylephorus limosus in 14d and 21d test were 222mg/kg dw and 106mg/kg dw, and the EC50of growth inhibition in 21d test was 81.7mg/kg dw. Comparing the Sediment quality criteria (SQC) of foreign countries with our results, we found that the existing SQC of pyrene were not suitable for China. We need much more toxicity data of pyrene on the benthic organisms in sediments to derive pyrene’s SQC. The results of this study would provide a basis for deriving SQC and assessing ecological risk of pyrene.
pyrene;toxic effect;benthic organisms;sediement
X131
A
1000-6923(2017)07-2765-08
鐘文玨( 1979 -) ,女,河北石家莊人,助理研究員,博士,主要從事水環境質量基準與生態風險評價研究.
2016-12-07
公益性行業(農業)科研專項(201503108);天津市自然科學基金資助項目(16JCYBJC29800);高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20130031120018);中央高校基本科研業務費專項資金資助(zla2076698)
* 責任作者, Zhuly@nankai.edu.cn