氧化石墨烯對雙殼類動(dòng)物文蛤的亞致死毒性研究

段偉艷,杜永祥,孟范平,林怡辰,周 琦 (中國海洋大學(xué),海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266100)

氧化石墨烯對雙殼類動(dòng)物文蛤的亞致死毒性研究

段偉艷,杜永祥,孟范平*,林怡辰,周 琦 (中國海洋大學(xué),海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266100)

為全面評價(jià)納米材料對海洋生物的毒性效應(yīng),將文蛤暴露于含氧化石墨烯(GO,5mg/L)的人工海水,測定其內(nèi)臟中的還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、金屬硫蛋白(MTs)以及血細(xì)胞的微核率(MNF)和溶酶體膜穩(wěn)定性(LMS)等7種生物標(biāo)志物的變化,分析GO對雙殼類的亞致死毒性機(jī)制.結(jié)果表明,GO能夠誘導(dǎo)文蛤內(nèi)臟的氧化逆境,表現(xiàn)為GSH含量降低、GSSG含量增加和MDA含量增加;GO產(chǎn)生的神經(jīng)毒性較小,AChE活性僅在暴露初期與結(jié)束時(shí)短暫受抑;GO對MTs無誘導(dǎo)作用;GO暴露4d后即產(chǎn)生顯著的遺傳毒性和溶酶體膜失穩(wěn),MNF達(dá)到對照組的6.1～9.0倍,中性紅保留時(shí)間(NRRT)降幅達(dá)到24.2%～49.2%.除AChE、MTs外,其它生化指標(biāo)均適于作為指示GO亞致死毒性的敏感生物標(biāo)志物.

氧化石墨烯(GO)；雙殼類；氧化逆境；微核率(MNF)；溶酶體膜穩(wěn)定性(LMS)

納米材料因其具有獨(dú)特的電學(xué)、催化和化學(xué)性質(zhì)而被大量應(yīng)用于商品和工業(yè)生產(chǎn)中[1].這不可避免造成其隨著廢水排入外部環(huán)境并最終進(jìn)入海洋中.海洋雙殼類屬于濾食性動(dòng)物,可通過內(nèi)吞作用和吞噬作用內(nèi)化納米粒子[2].因而成為納米材料毒理學(xué)研究的獨(dú)特目標(biāo)群體.同時(shí),雙殼類的某些生理生化指標(biāo)能夠?qū)o機(jī)、有機(jī)污染物產(chǎn)生靈敏響應(yīng),常被用作污染暴露和毒性效應(yīng)的早期預(yù)警[3-8].雙殼類動(dòng)物的健康直接關(guān)系到區(qū)域性水產(chǎn)品的產(chǎn)量,對人類社會(huì)的食品質(zhì)量和食品結(jié)構(gòu)有很大影響.因此,研究納米材料對海洋雙殼類的毒性效應(yīng)十分必要.

氧化石墨烯(GO)是一種具有極高抗菌活性的新型二維碳納米材料,由氧化石墨經(jīng)超聲或熱剝離得到,其片層上分布有羥基、環(huán)氧官能團(tuán)、羰基、羧基等含氧官能團(tuán)[9].毒理學(xué)研究證明,GO可以對生物造成明顯的不利影響.GO對斑馬魚(Danio rerio)具有中等生物毒性和一定的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),濃度為 50mg/L時(shí)輕微延遲胚胎脫殼,但不會(huì)導(dǎo)致胚胎明顯凋亡[10].GO對原生動(dòng)物小眼蟲(Euglena gracilis)的96h半效應(yīng)濃度(96h EC50)為(3.76±0.74)mg/L;2.5mg/L的GO即對小眼蟲產(chǎn)生明顯不利影響,其毒性來自遮光效應(yīng)和氧化逆境[11].GO對人類肝癌細(xì)胞株HepG2毒性實(shí)驗(yàn)表明[12],GO(＜20mg/L)不會(huì)降低細(xì)胞存活率、產(chǎn)生活性氧(ROS),或破壞線粒體功能,但低水平(0.05mg/L)GO可顯著降低細(xì)胞對其他外源性物質(zhì)的耐受性.

目前有關(guān)氧化石墨烯(GO)對海洋雙殼類毒理學(xué)效應(yīng)的研究報(bào)道很少.生態(tài)毒理學(xué)的研究認(rèn)為,外源性污染物能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量 ROS,攻擊細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子并引起生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),而生物體可通過還原型谷胱甘肽(GSH)等非酶類抗氧化物質(zhì)消除污染逆境產(chǎn)生的 ROS,以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),期間, GSH自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)[13],而丙二醛(MDA)則是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物[14].因此,細(xì)胞中GSH、GSSG、MDA含量的變化常用于指示污染脅迫下的氧化逆境程度.ROS能引起DNA雙鏈斷裂,進(jìn)而造成微核數(shù)量增加[15],微核率(MNF)可在染色體水平上表征污染暴露下的遺傳毒性[16].污染脅迫還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫中具有重要作用的溶酶體發(fā)生腫脹、破裂,釋放其中的水解酶到細(xì)胞質(zhì)中從而損傷細(xì)胞.因此,溶酶體膜穩(wěn)定性(LMS)可從細(xì)胞水平上反映環(huán)境脅迫造成的功能性受損程度[17].另外,在GO分散液中存在一定濃度的 Mn2+[18],而金屬離子既能誘導(dǎo)雙殼類動(dòng)物的金屬硫蛋白(MTs)合成還能影響乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性,從而表現(xiàn)出一定的金屬毒性和神經(jīng)毒性[13,19].據(jù)此,本研究以中國沿海分布廣泛的雙殼類動(dòng)物文蛤(Meretrix meretrix)為研究對象,通過測定其暴露于含GO的海水后,內(nèi)臟中的GSH、GSSG、MDA、AChE、MTs以及血細(xì)胞的MNF和LMS等7種生物標(biāo)志物的變化,分析GO對雙殼類的亞致死毒性機(jī)制,以期評價(jià)納米材料對海洋生物的毒性效應(yīng),為利用生物標(biāo)志物進(jìn)行海域水質(zhì)監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

人工海水:將一定量的海水晶(山東濰坊市海佳海水晶廠)溶于蒸餾水配制而成(鹽度(25±0.1),pH (7.9±0.1)).

GO分散液(棕色):購自中國廈門凱納石墨烯技術(shù)有限公司,采用改進(jìn)的Hummer法制備,濃度3000mg/L,介質(zhì)為超純水,pH值為5～7.使用前,將其分別用超純水和人工海水稀釋成濃度為5mg/L的工作液,超聲振蕩(45kHz,30min)使納米材料分散均勻.

文蛤:平均殼長為(3.9±0.3)cm,購自青島市嶗山灣大管島海域養(yǎng)殖區(qū),在溫度(15±1)°C條件下以人工海水馴養(yǎng)7d.期間每天更換新配制的人工海水,定時(shí)投加密度為 1.3×107cells/(L?d)的海水小球藻(Chlorella pacifica)作為文蛤的餌料,同時(shí)利用空氣泵持續(xù)充氧,使溶解氧(DO)保持在(6± 0.5)mg/L.

試劑:測定蛋白質(zhì)和 MDA的試劑盒購自南京建成生物工程研究所.Giemsa染色液、1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、谷胱甘肽(GSH)、5,5-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、多聚賴氨酸(MW 150000-300000)、碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)為 Sigma公司產(chǎn)品;鄰 苯 二 甲 醛 (OPT)、 NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、EDTA-2Na、β-巰基乙醇、三羥甲基胺基甲烷(Tris堿)等均為國產(chǎn)分析純;中性紅染料為國產(chǎn)生化試劑.

1.2 方法

1.2.1 GO性質(zhì)的表征方法 將GO工作液(超純水介質(zhì))旋涂(旋速2680g,時(shí)間30s)于云母基板上,45℃下自然風(fēng)干3h,置于Agilent 5400型原子力顯微鏡(AFM,美國安捷倫科技)下,采用輕敲模式觀察,利用PicoViewer軟件分析GO的直徑及厚度.將 GO分散液(超純水介質(zhì))加入干凈比色皿中,置于Nano S90型激光粒度分析儀(英國馬爾文公司)固定槽內(nèi),測量GO的粒徑分布.將GO分散液(超純水和人工海水介質(zhì))滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上,自然干燥后在 JEM-1200型透射電鏡(TEM,日本電子株式會(huì)社)下觀察 GO的形態(tài).GO工作液(超純水和人工海水介質(zhì))的Zeta電位采用JS94J2型Zeta電位儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)測定.

1.2.2 暴露培養(yǎng)方法 采用GO濃度為5mg/L的人工海水進(jìn)行文蛤的亞致死暴露培養(yǎng).選擇該濃度的依據(jù)為:預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在 GO 濃度為1～100mg/L的人工海水中暴露96h期間,文蛤死亡率均低于50%,且只在GO濃度大于5mg/L時(shí)觀察到個(gè)體開始死亡,并且死亡率隨 GO濃度的增大而升高.由于死亡個(gè)體所釋放的黏液易引起細(xì)菌滋生,會(huì)干擾亞致死毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

GO處理組設(shè)3個(gè)平行,即:在3個(gè)玻璃缸中,分別加入含 GO(5mg/L)的人工海水 5L,各投放經(jīng)馴養(yǎng)的文蛤40只.另設(shè)一組(3只)玻璃缸,各加入5L人工海水(不含GO)和40只文蛤,作為對照組.在水溫(15±1)℃、鹽度(25±0.1)、DO(6± 0.5)mg/L和 pH值為(7.9±0.1)的條件下,于黑暗處連續(xù)培養(yǎng)16d[20-21].每天更換含GO的人工海水(對照組不含 GO),定時(shí)投加密度為 1.3× 107cells/(L·d)的海水小球藻.培養(yǎng)期間未觀察到個(gè)體死亡.暴露開始時(shí)和暴露 1、2、4、8、16d后,分別從每個(gè)玻璃缸中隨機(jī)取出 6只文蛤,其中2只抽取閉殼肌血竇處的血淋巴液,分別用于血細(xì)胞MNF和LMS測定;另外4只個(gè)體立即在冰上解剖,將分離出的內(nèi)臟切細(xì)混勻,于-80℃保存,用于生化指標(biāo)分析.

1.2.3 生物標(biāo)志物分析方法 (1)氧化應(yīng)激標(biāo)志物、AChE和蛋白質(zhì)測定 稱取適量解凍后的文蛤內(nèi)臟樣品混合樣,按照質(zhì)量體積比 1:4與Tris-HCl緩沖溶液(pH7.8, 20mmol/L)混勻,勻漿后離心(13000g,4℃,15min)得到上清液(避免取出其表層的脂肪層),用于測定GSH、GSSG、MDA含量以及AChE活性和蛋白質(zhì)濃度.

GSH和 GSSG測定:采用分光光度法[22]測定.GSH存在時(shí),OPT與氨基酸、肽等反應(yīng)生成熒光化合物,在激發(fā)波長350nm,發(fā)射波長430nm下,可用分子熒光光度計(jì)定量測定.GSSG測定原理與其相似,但需加入一定量的 N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM),以避免GSH與OPT反應(yīng)造成干擾.根據(jù)熒光強(qiáng)度值計(jì)算GSH、GSSG含量,單位為μmol/g prot.

MDA測定[23]:MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產(chǎn)物,根據(jù)532nm波長處吸光度對MDA進(jìn)行定量,單位為nmol/mg prot.

AChE測定:參照 Ellman等[24]的方法測定.測定原理:在AChE作用下,ATChI的分解產(chǎn)物與DTNB反應(yīng)生成 5-巰基-2-硝基苯甲酸,于412nm 波長處進(jìn)行比色測定,酶活力表示為μmol/(min·g prot).

蛋白質(zhì)測定:蛋白質(zhì)含量用于上述生物標(biāo)志物含量/活性計(jì)算.采用考馬斯亮藍(lán)法[25]測定,單位為g/L.

(2)MTs測定 將內(nèi)臟組織按質(zhì)量體積比1:4加入 pH 7.8的緩沖液(含 0.5mol/L 蔗糖, 0.02mol/L Tris-HCl,0.5mmol/L PMSF,0.01% β-巰基乙醇)中,于4℃下25000g離心30min后,上清液中MTs含量參照Viarengo等[26]的紫外分光光度法測定.根據(jù)MTs分子中-SH與DTNB反應(yīng)生成的黃色物質(zhì)在波長412nm具有最大吸收,進(jìn)行MTs定量,單位為μmol-SH/g ww(組織濕重).

(3)MNF測定 參照Bar?ien?等[16]的Giemsa染色法.對于每只文蛤,吸取100μL血淋巴涂布于多聚賴氨酸處理過的載玻片,室溫培養(yǎng) 30min.甲醇固定5min后,滴加10% Giemsa染液室溫染色15min,中性樹膠和蓋玻片封存后,在 100×油鏡下觀察計(jì)數(shù)(1000cells/個(gè)體),根據(jù)鏡檢發(fā)現(xiàn)的微核數(shù)量計(jì)算MNF(‰).

(4)LMS測定 采用Lowe等[17]的中性紅保留時(shí)間(NRRT)法.每只文蛤抽取40μL血淋巴液,涂布在多聚賴氨酸處理過的載玻片上,于潮濕箱中固定 3min.滴加 40μL中性紅使用液(0.01%),放置15min后進(jìn)行鏡檢.視野中約30%的細(xì)胞變紅之前,每隔15min鏡檢一次.之后改為每隔5min觀察一次,以細(xì)胞變紅數(shù)量達(dá)到50%的時(shí)間(min)作為 NRRT.如果在兩個(gè)相鄰時(shí)刻中間觀測到50%細(xì)胞變紅,則采用內(nèi)插法計(jì)算NRRT并取整. 1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 處理組、對照組中每種生物標(biāo)志物的測定結(jié)果均表示為3個(gè)玻璃缸的文蛤相應(yīng)指標(biāo)測定值的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差);MNF和LMS結(jié)果以3只文蛤(來自3個(gè)平行)測定值的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示.采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)每種生化因子在一定暴露時(shí)間下與對照組的差異顯著性(P＜0.05, P＜0.01).同時(shí),采用雙變量Pearson相關(guān)性分析,研究生化因子之間的關(guān)系,統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P＜0.05.

2 結(jié)果

2.1 納米材料的特性

由粒度分布圖(圖 1)和 AFM圖(圖 2)可見,超純水中,GO 為二維片層結(jié)構(gòu),長度 171.0～412.5nm(平均291.3nm),厚度為1.25nm.根據(jù)圖3,超純水中,GO表面為大量褶皺起伏的片層結(jié)構(gòu),相對較薄且透明;但是,人工海水中的GO顏色加深,呈深棕色,表明其在海水中發(fā)生一定程度的團(tuán)聚.此外,Zeta電位測定結(jié)果表明,GO在海水中的Zeta電位絕對值(17.18mV)低于其在超純水中的Zeta電位(47.05mV).

圖1 GO的粒徑分布Fig.1 The particle size distribution for GO

圖2 GO的AFM圖Fig.2 AFM image of GO

圖3 超純水(a)和人工海水(b)中GO的TEM圖Fig.3 The TEM images of GO in Mili-Q water (a) and artificial seawater (b)

2.2 文蛤內(nèi)臟的GSH和GSSG水平

圖4顯示了GO暴露下文蛤內(nèi)臟中GSH、GSSG含量隨時(shí)間的變化.培養(yǎng)16d期間,對照組中兩種生物標(biāo)志物的含量變化范圍分別為1.54～1.58和 0.65～0.67μmol/g prot,波動(dòng)幅度不大.GO暴露下,內(nèi)臟 GSH含量始終低于對照組(P＜0.05),降幅最大值為58.77%,出現(xiàn)在暴露1d后.隨后GSH含量有所回升,但始終顯著低于同期的對照組水平(P＜0.05).伴隨著GSH含量的降低,內(nèi)臟GSSG主要表現(xiàn)為含量上升,且在大多數(shù)暴露時(shí)間內(nèi)(除暴露 4d外)顯著高于對照組(P＜0.05),最高值(0.88μmol/g prot)出現(xiàn)在暴露1d后.

圖4 GO暴露下文蛤內(nèi)臟GSH、GSSG的含量變化Fig.4 Variation of GSH and GSSG in the viscera of M. meretrix exposed to GO as a function of time

2.3 文蛤內(nèi)臟的脂質(zhì)過氧化程度

培養(yǎng)16d期間,對照組的文蛤內(nèi)臟MDA含量變化范圍為 2.41～2.57μmol/g prot,波動(dòng)幅度不大(圖5).暴露于GO后,內(nèi)臟MDA含量顯著高于對照組(P＜0.05),以暴露 2d后的增幅最大(23.79%).

2.4 文蛤內(nèi)臟的AChE活性和MTs含量

根據(jù)圖6,GO僅在暴露初期(第1d)和暴露末期(第16d)對AChE活性產(chǎn)生抑制,抑制率分別為34.41%(P＜0.01)和 8.88%(P＜0.05).而在暴露 4d后,AChE活性受到刺激(P＜0.05),其最大值為2.59μmol/(min·g prot),比對照組上升19.91%.GO暴露期間,未見到內(nèi)臟 MTs含量的顯著變化(P＞0.05).

圖5 GO暴露下文蛤內(nèi)臟MDA含量變化Fig.5 Variation of MDA in the viscera of M. meretrix exposed to GO as a function of time

圖6 GO暴露下文蛤內(nèi)臟AChE活性(a)和MTs含量(b)隨暴露時(shí)間的變化Fig.6 Variation of AchE and MTs in the viscera of M. meretrix exposed to GO as a function of time

2.5 文蛤血細(xì)胞的微核率和溶酶體膜穩(wěn)定性

根據(jù)圖 7(a),培養(yǎng)期間對照組文蛤的血細(xì)胞MNF在0.66‰～1.97‰之間小幅波動(dòng).GO處理組的血細(xì)胞MNF自暴露4d后開始顯著高于對照組(P＜0.05),并隨著暴露時(shí)間延長不斷升高,暴露結(jié)束時(shí)達(dá)到對照組的 8.58倍.文蛤血細(xì)胞的LMS(以 NRRT表示)總體上隨暴露時(shí)間延長呈逐漸降低態(tài)勢(圖 7(b)).自 GO暴露 4d后開始,NRRT顯著低于對照水平,降幅為 24.68%～50.67%.

圖7 GO暴露下文蛤血細(xì)胞MNF和NRRT的變化Fig.7 Variation of MNF and NRRT in the hemolymph of M. meretrix exposed to GO as a function of time

3 討論

3.1 文蛤?qū)O的攝入

GO在超純水中分散均勻,呈單層或多層薄片狀,但在人工海水中則形成較大的聚集體.這與其在海水中的 Zeta電位(絕對值)較低相一致. Zeta電位是膠體粒子之間相互排斥或吸引強(qiáng)度的度量,可表征膠體分散系的穩(wěn)定性.一般認(rèn)為[27],當(dāng)Zeta電位值(絕對值)在40～60mV之間時(shí)穩(wěn)定性較好;30～40mV時(shí)穩(wěn)定性一般,低于30mV膠體就開始變得不穩(wěn)定,至0～5mV時(shí)膠體會(huì)快速凝結(jié)或凝聚.根據(jù)Zeta電位(絕對值)判斷,GO在海水中處于不穩(wěn)定狀態(tài),這是高濃度電解質(zhì)引起電荷屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果,GO片層易于團(tuán)聚或通過與周圍粒子相互作用而團(tuán)聚,導(dǎo)致厚度增加和顏色加深.這種團(tuán)聚可促進(jìn) GO在海洋中的沉積,增加其被底棲生物攝食的可能性[28-29],進(jìn)而提高其對雙殼類動(dòng)物的污染風(fēng)險(xiǎn).Hu等[30]采用熒光素標(biāo)記的 GO(10mg/L)對普通小球藻(C. vulgaris)暴露培養(yǎng),在藻細(xì)胞內(nèi)檢測到很強(qiáng)的熒光信號,表明GO能夠進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部.但是尚未見到有關(guān) GO能否進(jìn)入海洋動(dòng)物細(xì)胞的研究報(bào)道.有文獻(xiàn)提出生物對GO的攝取機(jī)制為: 500nm以下的小片層 GO主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用或絲狀偽足包裹進(jìn)入細(xì)胞,而1～2μm的大片層GO則主要通過吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞[31-32].

3.2 GO暴露下文蛤內(nèi)臟氧化應(yīng)激響應(yīng)

GSH是生物細(xì)胞中一種重要的抗氧化劑.細(xì)胞內(nèi)GSH含量保持在一定水平,對于維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抵抗重金屬毒性以及氧化脅迫至關(guān)重要.目前普遍認(rèn)為碳納米材料致毒機(jī)制是通過誘導(dǎo)活性氧(ROS)而對生物體造成氧化性損傷[33].GSH在清除體內(nèi)ROS的過程中被氧化為GSSG,因此,在污染逆境造成GSH含量降低的同時(shí),GSSH含量則相應(yīng)增加[34].對于輕微氧化逆境,細(xì)胞自身可通過調(diào)節(jié) GSH含量以維持細(xì)胞正常代謝,即:細(xì)胞中GR(谷胱甘肽還原酶)利用NADPH作為電子供體,催化 GSSG的二硫鍵還原,重新生成GSH,以保持氧化逆境下適宜的GSH/GSSG比值,維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡[35].但是,嚴(yán)重的氧化逆境會(huì)破壞這種適應(yīng)性機(jī)制,造成GSH降低[36],導(dǎo)致 ROS大量積累,使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,形成MDA等活性物質(zhì).

GO可對文蛤內(nèi)臟組織產(chǎn)生氧化脅迫,表現(xiàn)為內(nèi)臟 GSH含量在整個(gè)暴露期的降低(圖 4(a))和GSSG含量顯著增加(圖4(b)).這表明GSH在消除ROS方面起著主要作用,且在暴露初期消耗較多;暴露后期,GSH含量有所回升(但始終顯著低于對照組),相應(yīng)地,GSSG含量增幅減小,可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)GR活性受到誘導(dǎo)而催化GSSG快速還原為GSH所致.低濃度污染物能夠刺激雙殼類動(dòng)物 GR活性已在室內(nèi)研究[37]和現(xiàn)場調(diào)查[38]中得到證實(shí).暴露期間的GSH、GSSG含量呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.872,P＜0.05),進(jìn)一步證明兩者之間的此消彼長關(guān)系,也意味著 GO引起的文蛤內(nèi)臟氧化損害主要是通過積累ROS而實(shí)現(xiàn).GO對文蛤產(chǎn)生氧化脅迫的另一個(gè)證明是,內(nèi)臟 MDA含量在整個(gè)暴露期間顯著增加(除暴露 16d外) (圖6).這是內(nèi)臟中的GSH無法及時(shí)清除ROS的結(jié)果,即:過度積累的 ROS攻擊細(xì)胞中的生物大分子,引起膜脂質(zhì)過氧化.暴露末期,MDA含量顯著低于對照組水平(P＜0.01),可能是因?yàn)槲母騼?nèi)臟中的其它抗氧化成分受到激活,與GSH協(xié)同作用,而使ROS被有效清除.

3.3 GO對文蛤的金屬毒性與神經(jīng)毒性

作為生物體內(nèi)一類富含半胱氨酸的非酶蛋白,MTs通過其分子中的-SH與金屬離子結(jié)合而起到重金屬解毒作用[39].本研究中,文蛤內(nèi)臟MTs始終對 GO無顯著響應(yīng)(P＞0.05)(圖 6(b)),表明GO在海水中所釋放的金屬離子不足以誘導(dǎo)MTs合成.GO分散液中的主要金屬離子為Mn2+,因?yàn)镠ummer法制備GO時(shí)需使用KMnO4[40],MnO4-在酸性GO分散液中被還原為Mn2+.有文獻(xiàn)報(bào)道廠家提供的 GO 分散液中 Mn2+濃度小于10mg/L[18].按此計(jì)算,本研究中,由 GO分散液稀釋600倍而成的含GO人工海水中Mn2+濃度不會(huì)超過20μg/L.逯云召[41]將海洋雙殼類—馬氏珠母貝(Pinctada martensii Dunker)暴露于200μg/L的Mn2+,熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,其金屬硫蛋白基因在暴露 15d后才出現(xiàn)顯著上調(diào),而同樣條件下,10μg/L的Cu2+、40μg/L的Zn2+則在暴露10d時(shí)即能誘導(dǎo)金屬硫蛋白基因的顯著表達(dá). Mn2+對金屬硫蛋白基因的弱誘導(dǎo)能力,可以解釋本研究的暴露體系中低濃度Mn2+對文蛤MTs無誘導(dǎo)能力的現(xiàn)象.

AChE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶,能催化乙酰膽堿(ACh)水解生成膽堿和乙酸,終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的刺激,使神經(jīng)沖動(dòng)在動(dòng)物體內(nèi)能夠正常傳遞.污染物暴露下,生物體 AChE活性常被抑制,影響到生物的攝食、游泳行為以及識別、規(guī)避天敵的能力,從而降低生物的生存能力[42],因此常被作為評價(jià)污染物亞致死毒性效應(yīng)的敏感標(biāo)志物之一[43].一般認(rèn)為[44],AChE活性抑制率大于 20%時(shí),只能顯示暴露毒性作用的存在;抑制率大于50%時(shí)才能對生物生存產(chǎn)生危害.目前,有關(guān)GO對水生生物AChE的影響未見報(bào)道.本研究中,GO處理組的文蛤內(nèi)臟AChE活性在暴露初期、末期明顯降低(P＜0.05),但是抑制率均不足50%(圖6(a)),表明暴露期間GO對文蛤只是表現(xiàn)出暴露毒性作用,尚未威脅到文蛤生存.暴露 1d后的 AChE活性受抑,可能是進(jìn)入內(nèi)臟的GO 誘導(dǎo) ROS所致.有文獻(xiàn)報(bào)道[45],高濃度ROS(H2O2等)對AChE活性具有抑制作用;暴露末期,內(nèi)臟中的氧化逆境程度減弱,ROS產(chǎn)生量相應(yīng)較低,此時(shí)的AChE活性抑制則可能是由于GO自身所含Mn2+[46]在文蛤內(nèi)臟中積累所致.今后應(yīng)進(jìn)行更長時(shí)間的暴露研究,以便更好理解文蛤AChE對GO暴露的響應(yīng)機(jī)制.暴露4d時(shí)內(nèi)臟AChE活性受到短暫誘導(dǎo),這種現(xiàn)象僅見于少數(shù)研究報(bào)道.Gonzalez-Rey等[47]用75ng/L的氟西汀(FLX,治療抑郁癥的一種藥物)暴露培養(yǎng)地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis),至第3d時(shí)貽貝鰓AChE活性顯著上升,且在暴露末期(第15d)受到抑制,與本研究結(jié)果有相似之處.至于AChE活性受到誘導(dǎo)的原因,有待進(jìn)一步研究.

3.4 GO對文蛤的遺傳損傷

生物體暴露于某些化學(xué)物質(zhì)時(shí),處于分裂間期的細(xì)胞染色體受到傷害而斷裂,這些斷片在進(jìn)入分裂后期時(shí)滯留在赤道板附近,形成圓形或橢圓形小核(即微核)并游離于子細(xì)胞質(zhì)中.通過微核試驗(yàn)測定的微核率(MNF)可在染色體水平上表征 DNA的損傷程度[48].已有學(xué)者利用地中海貽貝(M. galloprovincialis)、紫貽貝(M. edulis)等雙殼類動(dòng)物的MNF監(jiān)測海洋環(huán)境污染物的致畸性和遺傳毒性效應(yīng),其中,血細(xì)胞是常用的試驗(yàn)材料[16,49].GO 對水生生物的遺傳毒性研究尚未見報(bào)道,但有學(xué)者[50]將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞暴露于GO(10mg/L,24h)觀察到明顯的細(xì)胞 DNA損傷,并推測毒性作用可能通過氧化應(yīng)激介導(dǎo).根據(jù)本研究的文蛤血細(xì)胞 MNF測定結(jié)果(圖 7(a)),GO能夠在短時(shí)間內(nèi)(暴露 4d后)對文蛤造成遺傳損害,且隨著暴露時(shí)間延長而不斷加重.血細(xì)胞MNF的這種高敏感性使其在指示GO的海洋生態(tài)毒性方面具有較大優(yōu)勢.GO對生物體產(chǎn)生的遺傳毒性可能來自兩種途徑:①在生物體內(nèi)誘導(dǎo)生成的ROS攻擊染色體;②GO直接進(jìn)入細(xì)胞與DNA相互作用[51].

3.5 GO暴露下的文蛤整體健康狀態(tài)

溶酶體是由單層膜包裹的細(xì)胞器,在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用,是許多環(huán)境污染物的共同靶點(diǎn).在污染物脅迫下,雙殼類血細(xì)胞的溶酶體會(huì)發(fā)生腫脹或出現(xiàn)膜穩(wěn)定性(LMS)下降[52].LMS常以 NRRT表征,可指示細(xì)胞的整體健康狀態(tài)[53].該生物標(biāo)志物被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署“地中海污染監(jiān)測項(xiàng)目(MEDPOL)”專家認(rèn)為是水質(zhì)評價(jià)中最可靠的生物標(biāo)志物[54].國際海洋勘探委員會(huì)《奧斯陸巴黎保護(hù)東北大西洋海洋環(huán)境公約》研究小組[55]基于雙殼貝類LMS(以NRRT表征)制定的細(xì)胞健康分級閾值如下:當(dāng)NRRT＞120min時(shí),認(rèn)為貝類是健康的;當(dāng) NRRT 在 50～120min時(shí),貝類受到脅迫但可恢復(fù);當(dāng) NRRT＜50min時(shí),貝類則遭受嚴(yán)重脅迫,可能出現(xiàn)病理特征.據(jù)此推斷,本研究所用文蛤在GO暴露前以及暴露1～2d后處于健康狀態(tài)(圖 7(b)),但是,自暴露 4d開始NRRT值顯著降低(97～62min),表明文蛤血細(xì)胞溶酶體膜因 GO脅迫而受到明顯損傷.目前雖然未見GO對雙殼類LMS的研究報(bào)道,但是,已有研究發(fā)現(xiàn),納米炭黑(NCB)、富勒烯(C60)等碳納米材料的濃度為0.05～5mg/L時(shí),可觀察到地中海貽貝(M. galloprovincialis)血細(xì)胞的溶酶體膜失穩(wěn)[56].雙殼類屬于濾食性動(dòng)物,水中的納米材料等污染物被其鰓捕獲后,轉(zhuǎn)移至內(nèi)臟,最后進(jìn)入血淋巴參與血液循環(huán)[4],在血細(xì)胞中產(chǎn)生和積累ROS,導(dǎo)致溶酶體膜的損傷.與血細(xì)胞MNF相同,LMS同樣可作為敏感指示海洋環(huán)境中 GO污染水平的生物標(biāo)志物.暴露期間兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.990, P＜0.01),則表明血細(xì)胞MNF和LMS聯(lián)合應(yīng)用于GO亞致死毒性評價(jià)具有更好的效果.

4 結(jié)論

4.1 GO對文蛤內(nèi)臟能夠產(chǎn)生氧化脅迫,主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:①內(nèi)臟GSH含量降低和GSSG含量的增加;②內(nèi)臟 MDA含量幾乎在整個(gè)暴露期持續(xù)受到誘導(dǎo).這是過度積累的ROS攻擊細(xì)胞生物大分子引起膜脂過氧化所致.

4.2 GO對文蛤的神經(jīng)毒性較小,僅在暴露初期(第1d)和暴露末期(第16d)受到短暫抑制.GO對文蛤不產(chǎn)生金屬毒性,表現(xiàn)為內(nèi)臟MTs未受誘導(dǎo).

4.3 GO對文蛤的遺傳毒性很高,并能造成血細(xì)胞溶酶體膜失穩(wěn).血細(xì)胞MNF和NRRT均在暴露4d后即出現(xiàn)顯著變化,前者達(dá)到對照組的6.1～9.0倍,后者降幅達(dá)到 24.2%～49.2%.因此,兩者可作為指示 GO對雙殼類亞致死毒性的重要生物標(biāo)志物.

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The sublethal toxicity of graphene oxide to bivalve Meretrix meretrix.

DUAN Wei-yan, DU Yong-xiang, MENG Fan-ping*, LIN Yi-chen, ZHOU Qi (Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2755～2764

In the present study, the experimental clams Meretrix meretrix were exposed to GO in artificial seawater (5mg/L) in order to comprehensively evaluate the toxicity of graphene nanomaterials to marine organisms. Mechanism of the sublethal toxicity caused by GO to clams was explored by monitoring of seven biomarkers including the reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione (GSSG), malondialdehyde (MDA), acetylcholinesterase (AChE) and metallothioneins (MTs) in the digestive gland, as well as micronucleus frequency (MNF) and lysosomal membrane stability (LMS) of hemolymph. Results demonstrated that the oxidative stress was induced by GO in the digestive gland of clams, while the content of GSH decreased and both of GSSG and MDA increased. Weak neurotoxicity was caused by GO, which was indicated by the temporary inhibition of AChE activity at the initial and end of exposure stages. No obvious induction of MTs was observed in the whole period of exposure. However, significant genotoxicity and lysosomal membrane instability occurred after 4-d exposure. The MNF of experimental groups reached to 6.1～9.0 times of the blank control levels, but the neutral red retention time (NRRT) decrease of the positive treatments was about 24.2%～49.2% of the blank control group. Except for the biomarkers AChE and MTs, other parameters were testified as suitable and sensitive indicators to assess the sublethal toxicity of GO in this study.

graphene oxide (GO)；bivalves；oxidative stress；micronucleus frequency (MNF)；lysosomal membrane stability (LMS)

X171,X835

A

1000-6923(2017)07-2755-10

段偉艷(1992-),女,河北沙河人,中國海洋大學(xué)博士研究生,主要從事海洋污染生態(tài)效應(yīng)研究.

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41276104)

* 責(zé)任作者, 教授, mengfanping@ouc.edu.cn