云南松松塔提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響

吳道勛，張娜，邵維莉，楊賢英，陳進(jìn)汝，劉熙，2

1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

云南松松塔提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響

吳道勛1，張娜1，邵維莉1，楊賢英1，陳進(jìn)汝1，劉熙1，2

1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

目的 觀察云南松松塔提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用酒精灌胃制備急性酒精性肝損傷小鼠模型。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組和云南松松塔低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，每日 1 次，連續(xù) 7 d。末次灌胃 3 h 后，計(jì)算肝、脾指數(shù)，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、微量還原型谷胱甘肽（GSH）活性，HE 染色觀察肝臟病理形態(tài)。結(jié)果 與模型組比較，云南松松塔各劑量組小鼠肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01），云南松松塔高劑量組脾指數(shù)顯著降低（P＜0.01），云南松松塔中、高劑量組血清 AST 含量顯著降低（P＜0.01），云南松松塔各劑量組肝組織 GSH 活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；云南松松塔低、高劑量組肝組織 MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；云南松松塔各劑量組血清 ALT 含量降低，肝組織 SOD 活性升高和 NO 含量降低，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HE 染色結(jié)果顯示，云南松松塔各劑量組小鼠肝組織損傷較模型組明顯改善。結(jié)論 云南松松塔提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用。

云南松松塔提取物；急性酒精性肝損傷；氧化因子；小鼠

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是酗酒導(dǎo)致的肝臟損害性疾病，在病理組織學(xué)上按照肝細(xì)胞發(fā)生脂肪病變的程度分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。ALD是一種進(jìn)行性發(fā)展且后期嚴(yán)重危害身體健康和威脅生命安全的疾病，其致病因素單一、明確，即長(zhǎng)期大量的飲酒所致，但發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全明了，目前治療手段主要是戒酒、營養(yǎng)支持和藥物治療。松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的球果，別名松實(shí)、松元、松果、松球。松科松屬植物約 80 種，多分布于北半球，我國有 22 種，10 個(gè)變種。云南松是松科常綠針葉喬木，主要分布于我國西南地區(qū)，在云南全省幾乎都有分布，資源十分豐富。松香、松實(shí)、松針歷代都有入藥使用。本實(shí)驗(yàn)采用酒精灌胃制備急性酒精性肝損傷小鼠模型，觀察云南松松塔提取物對(duì)急性酒精性肝損傷的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性昆明種小鼠 60 只，6～8 周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量（18±5）g，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可格證號(hào) SCXK（滇）2011-0006。飼養(yǎng)于溫度 22～25 ℃、濕度 50%～80%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

云南松松塔提取物，大理大學(xué)劉光明教授提供，批號(hào) 20160621；聯(lián)苯雙酯滴丸，萬邦德制藥股份有限公司，批號(hào) A020150302。

1.3 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、微量還原型谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）試劑盒，南京建成生物工程研究所；56度紅星二鍋頭白酒，北京紅星釀酒總廠；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，型號(hào) XK96-A），高速低溫離心機(jī)（丹麥LABOGENE 公司，型號(hào) 1580MGR 型），梅特勒電子天平（瑞士，型號(hào) AE240）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 d 后，60 只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯 75 mg/kg）和云南松松塔低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg），每組 10只。各組小鼠均灌胃給藥，正常組和模型組給予等量生理鹽水。給藥體積為 0.02 m L/g，每日 1次，連續(xù) 7 d。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[1]方法和本批昆明種小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造模。小鼠每日下午灌胃給藥 3 h 后，除正常組外，其他各組小鼠給予 56 度紅星二鍋頭白酒（5 m L/kg）灌胃制備酒精性肝損傷模型，正常組給予等量生理鹽水灌胃。第 7 日給藥、給酒后禁食不禁水，3 h 后稱重，采集血液、肝臟、脾臟進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 小鼠肝、脾指數(shù)檢測(cè) 小鼠采血后脫頸處死，取小鼠肝臟和脾臟，置于冷的 0.9%氯化鈉注射液中潤(rùn)洗，濾紙吸干，肉眼觀察外觀，稱重，計(jì)算肝、脾指數(shù)。肝指數(shù)（%）＝肝質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）×100%，脾指數(shù)（%）＝脾質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）×100%。

2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠采用摘除眼球法采血，3500 r/m in 離心 10 m in，分離血清，按試劑盒說明書測(cè)定血清 ALT、AST 含量和 GSH 活性。剪下小鼠肝左葉相同部位肝組織，4 ℃生理鹽水制備成 10%肝勻漿，3000 r/m in 離心 10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定肝組織 SOD 活性和 MDA、NO含量。

2.3.3 肝臟組織病理觀察 取小鼠肝臟次大肝葉，置于 10%甲醛溶液中保存，組織切片，HE 染色，光鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s 表示，組間比較用方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 云南松松塔提取物對(duì)模型小鼠肝、脾指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝、脾指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組和云南松松塔高劑量組脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），陽性對(duì)照組和云南松松塔組低、中、高劑量組肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表 1。

表 1 各組小鼠肝、脾指數(shù)比較（±s，%）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù)劑量/（mg/kg）肝指數(shù) 脾指數(shù)正常組 10 4.63±0.56 0.37±0.03模型組 10 5.36±0.47** 0.44±0.03**陽性對(duì)照組 10 75 4.40±0.57△△ 0.38±0.05△△云南松松塔低劑量組 10 100 4.64±0.35△△ 0.32±0.04云南松松塔中劑量組 10 200 4.29±0.17△△ 0.40±0.09云南松松塔高劑量組 10 400 4.13±0.47△△ 0.28±0.04△△

4.2 云南松松塔提取物對(duì)模型小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清 ALT、AST 含量顯著升高（P＜0.01），GSH 活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，云南松松塔中、高劑量組和陽性對(duì)照組血清 AST 含量顯著降低（P＜0.01），各給藥組血清GSH 活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表 2。

4.3 云南松松塔提取物對(duì)模型小鼠肝勻漿超氧化物歧化酶、丙二醛和一氧化氮水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝勻漿 SOD 活性顯著降低，MDA、NO 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組肝勻漿 SOD 活性顯著升高，MDA、NO 含量顯著降低（P＜0.05），云南松松塔低、高劑量組肝勻漿 MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表 2 各組小鼠血清 ALT、AST、GSH 水平比較（±s）

表 2 各組小鼠血清 ALT、AST、GSH 水平比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/（mg/kg） ALT/（U/L） AST/（U/L） GSH/（μmol/L）正常組 10 14.78±3.02 16.05±2.93 2.12±0.49模型組 10 23.15±7.68** 30.59±5.03** 1.56±0.40**陽性對(duì)照組 10 75 16.86±7.65 24.41±2.91△△ 2.26±0.70△云南松松塔低劑量組 10 100 18.62±3.90 29.30±0.68 2.28±0.48△云南松松塔中劑量組 10 200 19.19±3.34 21.59±3.87△△ 2.55±0.44△△云南松松塔高劑量組 10 400 16.89±1.64 15.20±0.95△△ 2.60±0.53△△

表 3 各組小鼠肝組織 SOD、MDA、NO 水平比較（±s）

表 3 各組小鼠肝組織 SOD、MDA、NO 水平比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/（mg/kg） SOD/（U/mg） MDA/（nmol/mg） NO/（μmol/mg)正常組 10 26.83±0.79 61.00±6.58 0.67±0.50模型組 10 23.83±0.87** 81.69±7.89** 1.14±0.43**陽性對(duì)照組 10 75 25.18±1.57△ 72.18±7.52△ 0.71±0.06△云南松松塔低劑量組 10 100 24.22±2.45 65.73±7.72△ 0.69±0.63云南松松塔中劑量組 10 200 24.16±1.47 71.32±8.58 0.70±0.29云南松松塔高劑量組 10 400 25.14±1.71 70.91±4.19△ 0.61±0.30

4.4 云南松松塔提取物對(duì)模型小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無明顯病變；模型組小鼠肝組織較正常組變化顯著，肝細(xì)胞明顯腫脹，呈氣球樣變及脂肪變性，胞質(zhì)疏松，其內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等脂滴，部分細(xì)胞核溶解、壞死，壞死灶內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組肝細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪變性較模型組減輕。見圖 1。

圖 1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)（HE 染色，×100）

5 討論

胃灌注酒精和腹腔注射酒精是目前國內(nèi)外對(duì)酒精性肝損傷主要的2種造模方法。由于腹腔注射死亡率較高，而胃灌注酒精造模周期短、易復(fù)制、穩(wěn)定性好、死亡率低，與人飲酒所致的肝損傷特點(diǎn)相符，對(duì)研究酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制和篩選藥物起著關(guān)鍵作用。酒精性肝損傷模型與現(xiàn)代人過度飲酒造成的肝損害相似，而且以肝臟及血中某些化學(xué)指標(biāo)改變?yōu)橹饕卣鳎茄芯考毙跃凭愿螕p傷發(fā)病機(jī)制和后續(xù)保肝藥物及保護(hù)機(jī)制研究的理想模型[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用白酒灌胃制備急性酒精性肝損傷模型。

酒精代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的毒理作用、氧化應(yīng)激、炎癥損失、細(xì)胞凋亡、病毒的疊加作用等可能是酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制[3]。小鼠酒精灌胃會(huì)導(dǎo)致消化道損傷，且酒精 95%以上是由肝臟代謝造成肝細(xì)胞損傷[4]。因此，小鼠在造模后第3日開始出現(xiàn)明顯的飲食量減少、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)漸漸失去光澤、精神萎靡不振等表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組上述狀況較模型組稍好。

有研究表明，急性酒精中毒會(huì)損傷肝細(xì)胞中細(xì)胞器及酶的結(jié)構(gòu)功能，影響脂肪酸在線粒體內(nèi) β-氧化，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜損傷[5]。AST 和ALT 是存在于肝臟中重要的轉(zhuǎn)氨酶，肝細(xì)胞損傷或壞死，均會(huì)使血液中這2種轉(zhuǎn)氨酶的活性升高，因此臨床上將 AST 和 ALT 作為肝臟是否受到損害的指標(biāo)。ALT 主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)可進(jìn)入血中，引起血 ALT 升高。AST 也存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，并分布于線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損害嚴(yán)重時(shí)，線粒體內(nèi)AST 釋放入血，使血清 AST 升高大于 ALT[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組較正常組肝、脾指數(shù)增大，血清ALT 和 AST 水平顯著升高，表明肝細(xì)胞受損嚴(yán)重。相比之下，云南松松塔各劑量組對(duì) ALD 小鼠的肝、脾腫脹有一定抑制作用，能改善肝臟病變，使血清ALT、AST 向正常水平恢復(fù)。

機(jī)體內(nèi)的自由基清除防御體系主要由抗氧化酶體系和非酶體系組成。SOD 是生物體抗氧化酶防御體系的主要組成部分，它能有效清除活性氧自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在抗氧方面起到了重要作用。其酶活性的降低將導(dǎo)致氧自由基蓄積，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。MDA 是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。NO在生物體內(nèi)作為一種反應(yīng)極強(qiáng)的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，同時(shí)又是一種效應(yīng)分子，在體內(nèi)具有廣泛的生理作用，如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)腦流量、介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等，NO產(chǎn)生異常與某些疾病的發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，預(yù)先給予云南松松塔提取物能顯著提高 SOD、GSH 活性，明顯降低 MDA 含量，NO 含量也有所下降。

本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)肝細(xì)胞片狀壞死等現(xiàn)象；云南松松塔提取物組肝損傷較模型對(duì)照組減輕，肝細(xì)胞及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列趨于正常，與陽性對(duì)照組相當(dāng)，基本接近正常水平。病理切片顯示和各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符，提示預(yù)先給予云南松松塔提取物可提高肝細(xì)胞對(duì)酒精的抵御能力，減輕肝損傷，增強(qiáng)肝細(xì)胞更新再生的能力。

綜上所述，云南松松塔提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與云南松松塔增強(qiáng)機(jī)體抗氧化和清除自由基的能力有關(guān)。

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Effects of Pinus Yunnanensis on Acute Alcoholic Liver Injury in M ice

SHAO Wei-li1, YANG Xian-ying1, CHEN Jin-ru1, LIU Xi1,2(1. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000, China; 2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China) WU Dao-xun1, ZHANG Na1,

Objective To study the effect of Pinus yunnanensis on acute alcoholic liver injury in rats and explore its mechanism. Methods A model of acute alcoholic liver injury in m ice was prepared by alcohol. The m ice were random ly divided into normal control group, model group, positive control group, Pinus yunnanensis low-, mediumand high-dose groups. M ice in the medicine group were given the corresponding medicine by gavage once a day for 7 days. After the last three hours of intragastric administration, the liver and spleen index, ALT, AST and GSH in serum, SOD, MDA and NO in liver homogenates were measured. Histopathological changes of liver were observed by HE staining. Results Compared With model group, Pinecone of Pinus unnanensis high-, medium- and low-dose groups could significantly reduce the liver index in m ice (P＜0.01), and high dose groups could significantly reduce the number of spleen (P＜0.01); The contents of AST in the medium- and high-dose groups significantly decreased (P＜0.01) and the GSH activity significantly increased (P＜0.05, P＜0.01). There was no significant difference in serum ALT level, SOD activity, GSH activity and NO content in the liver tissues of Pinus yunnanensis groups (P＞0.05). HE staining results showed that, the damage of liver tissue in m ice of Pinus yunnanensis was significantly improved compared With the model group. Conclusion Pinus yunnanensis has protective effects on acute alcoholic liver injury in mice.

Pinus yunnanensis; acute alcoholic liver injury; oxidation factors; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.011

R285.5

A

1005-5304(2017)08-0046-04

2016-12-21）

（

2017-01-22；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81260632）

劉熙，E-mai l：626585322@qq.com