HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC與CIK共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立和功能評(píng)估

王少揚(yáng), 林濤發(fā), 朱玲玲, 謝麗平

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 感染科， 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院 感染病學(xué)教研室， 福州 350003)

HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC與CIK共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立和功能評(píng)估

王少揚(yáng), 林濤發(fā), 朱玲玲, 謝麗平

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 感染科， 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院 感染病學(xué)教研室， 福州 350003)

目的 觀察在不同HBV抗原負(fù)載下誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(DC)同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)共培養(yǎng)后CIK的功能。方法 將2015年1月-2016年6月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院就診的13例慢性乙型肝炎患者作為研究對(duì)象，分離13例慢性乙型肝炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，并培養(yǎng)DC和CIK，設(shè)為CIK單獨(dú)培養(yǎng)組、DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組，培養(yǎng)完成后，用ELISPOT方法測(cè)定CIK產(chǎn)生IFNγ的能力，用HepG2.2.15細(xì)胞作為靶細(xì)胞，測(cè)定CIK的殺傷功能。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 結(jié)果 不同CIK試驗(yàn)組產(chǎn)IFNγ的水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.84，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg組產(chǎn)生的IFNγ水平最高；CIK殺傷率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.77，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg最為突出。結(jié)論 HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)可能是治療慢性乙型肝炎有效的細(xì)胞體系。

肝炎， 乙型， 慢性； 肝炎表面抗原， 乙型； 肝炎核心抗原， 乙型； 樹突細(xì)胞； 殺傷細(xì)胞

近幾年樹突狀細(xì)胞(DC)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell，CIK)在治療腫瘤方面的研究進(jìn)展迅速，特別是在相關(guān)抗原負(fù)載下的DC與CIK混合培養(yǎng)達(dá)到了相互協(xié)同增強(qiáng)各自免疫功能的目的，共培養(yǎng)后回輸治療惡性腫瘤顯示出更加有效的臨床療效[1]。現(xiàn)也有學(xué)者嘗試用不同的HBV抗原負(fù)載DC后再同自體CIK混合培養(yǎng)治療慢性乙型肝炎，初步顯示了一定的臨床療效，但用何種方式對(duì)DC負(fù)載培養(yǎng)兩者的協(xié)同效能最佳還存在不同的意見(jiàn)，有必要進(jìn)一步探討。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 將2015年1月-2016年6月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院感染科門診就診或住院的13例慢性乙型肝炎患者作為觀察對(duì)象，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]，并排除HCV、HIV等合并感染及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和其他因素造成的肝功能異常者。13例患者中男9例，女4例，平均(37.0±11.5)歲。本研究獲得所有患者的知情同意并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核。

1.2 DC的培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，由專職人員使用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自體外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到(1～3)×108以上，必須保證每位患者一套采集管道。收集的PBMC 重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，去除非貼壁細(xì)胞(培養(yǎng)CIK用)，加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml，刺激細(xì)胞向DC分化；第3天半量換液，并加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml；在培養(yǎng)的第6天，分別加入HBsAg、HBcAg、HBsAg和HBcAg各1 μg/ml混合物，刺激抗原特異性的DC產(chǎn)生。

1.3 CIK的培養(yǎng)及鑒定 收集的PBMC重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2條件下孵育2 h，收集非貼壁細(xì)胞，加入IFNγ 1000 U/ml培養(yǎng)，24 h 后加入CD3單克隆抗體1 μg/ml和rhIL-2 2000 U/ml，刺激CIK的生長(zhǎng)和增殖；第3天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)并補(bǔ)充rhIL-2 2000 U/ml；第7天收獲CIK，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力應(yīng)在80%以上，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表達(dá)。

1.4 DC和CIK共培養(yǎng)及鑒定 收集培養(yǎng)第7天的抗原負(fù)載的DC及CIK按1∶10 比例共培養(yǎng)，加入2000 U/ml rhIL-2，每3 d補(bǔ)充培養(yǎng)基及rhIL-2 2000 U/ml，第7天收集細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×1010個(gè)以上，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力應(yīng)在80%以上，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表達(dá)。

1.5 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)CIK產(chǎn)IFNγ的水平分別設(shè)立DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組，并設(shè)正對(duì)照孔(CIK+植物血凝素組)、負(fù)對(duì)照孔(CIK組)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種于96孔板，終體積100 μl，按說(shuō)明書逐步操作，并計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，記錄結(jié)果。

1.6 CIK的殺傷功能檢測(cè) 以HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞設(shè)立5組，分別為CIK單獨(dú)培養(yǎng)組、DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組；RPMI1640重懸效應(yīng)細(xì)胞濃度為1×106/ml，靶細(xì)胞濃度為1×105/ml。將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞按10∶1比例混合，培養(yǎng)于96孔板中，終體積200 μl，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h。結(jié)果以DU 800分光光度儀，波長(zhǎng)450 nm測(cè)量的吸光度(OD值)表示；殺傷率的計(jì)算：殺傷率=1-[(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)組OD值)/靶細(xì)胞組OD值]。

2 結(jié)果

2.1 不同CIK試驗(yàn)組產(chǎn)IFNγ水平比較 多組間IFNγ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較，各組之間IFNγ水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg組產(chǎn)生的IFNγ最多(表1)。

表1 不同CIK試驗(yàn)組產(chǎn)生IFNγ的水平

2.2 不同試驗(yàn)組CIK殺傷功能比較 CIK組、DC+CIK組、DC+CIK+HBsAg組、DC+CIK+HBcAg組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg組的殺傷率依次分別為0.620±0.041、0.786±0.013、0.887±0.006、0.912±0.019、0.949±0.016，多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.77，P<0.001)，進(jìn)一步組間比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg組的殺傷率最高(圖1)。

圖1 不同分組CIK細(xì)胞殺傷功能的比較 *P=0.02, **P<0.001

3 討論

慢性乙型肝炎的治療主要是應(yīng)用IFNα與核苷和核苷酸類藥物，前者因僅有部分患者應(yīng)答，且具有明顯副作用，限制廣泛應(yīng)用；后者具有明顯的抗病毒療效，但長(zhǎng)期用藥易產(chǎn)生耐藥，且停藥后易復(fù)發(fā)，最為重要的是不能清除cccDNA，因此不能徹底清除病毒而達(dá)到治愈的目的，所以探討新的治療方法十分必要[2]。

目前DC和CIK治療是最有潛力的細(xì)胞免疫治療措施之一，有望能打破乙型肝炎患者的免疫耐受狀態(tài)而達(dá)到徹底清除病毒的目的。DC是已知的體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，可以直接激活在體內(nèi)的原始T淋巴細(xì)胞，這是誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。研究證實(shí)慢性乙型肝炎患者存在DC功能的缺失，具體表現(xiàn)在細(xì)胞表面的共刺激分子CD80/CD86和人類白細(xì)胞抗原Ⅱ的表達(dá)減少，產(chǎn)生IL-12等細(xì)胞因子的能力、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力降低，外周血單核細(xì)胞中產(chǎn)IFNγ的DC前體細(xì)胞的數(shù)量和功能也顯著下降，而通過(guò)體外相關(guān)抗原的誘導(dǎo)可恢復(fù)和改善DC功能，具有抑制HBV復(fù)制的效果[4-6]。CIK細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞群體，主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞，既具有T淋巴細(xì)胞的功能，又具有自然殺傷細(xì)胞的功能，并且不具有主要組織相容性抗原的限制，在體外可以大量擴(kuò)增復(fù)制，具有明顯的臨床應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)臨床觀察也具有一定的抗HBV的作用[7]。這兩類細(xì)胞已經(jīng)在治療腫瘤方面做了大量的基礎(chǔ)和臨床研究工作[8]。而在慢性乙型肝炎治療方面，雖然已有許多探索性研究報(bào)道，但仍有許多問(wèn)題有待解決。CIK所誘導(dǎo)的是非特異性免疫應(yīng)答效應(yīng)，雖然有一定的抑制HBV復(fù)制的療效，但療效多數(shù)是一過(guò)性的，不能長(zhǎng)期維持，所以僅有部分患者產(chǎn)生臨床療效。DC可以誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答效應(yīng)，并且維持持久的免疫應(yīng)答能力，但是DC培養(yǎng)相對(duì)困難，并且細(xì)胞擴(kuò)增的數(shù)量十分有限，難以達(dá)到臨床治療的需要。

在DC培養(yǎng)方面，如何給予抗原負(fù)載誘導(dǎo)也是決定DC功能恢復(fù)和增強(qiáng)的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HBsAg、HBcAg具有更強(qiáng)的免疫應(yīng)答效果，如Shi等[9]利用HBcAg作為負(fù)載抗原較HBsAg所產(chǎn)生的DC會(huì)誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)，且誘導(dǎo)共刺激分子的表達(dá)，如CD80、CD83、CD1a等明顯增強(qiáng)。Duan等[10]也做了類似的研究，以HBcAg負(fù)載的DC會(huì)誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)。筆者近期研究發(fā)現(xiàn)將HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能力高于單獨(dú)抗原誘導(dǎo)。對(duì)DC和CIK混合培養(yǎng)，在腫瘤患者中研究發(fā)現(xiàn)，和單獨(dú)培養(yǎng)相比，無(wú)論DC功能的恢復(fù)還是CIK功能的改善均有明顯的提高，兩者混合培養(yǎng)有明顯的協(xié)同作用[11]。經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，同單獨(dú)CIK培養(yǎng)相比，DC和CIK混合培養(yǎng)后CIK功能明顯得到提高，產(chǎn)生IFNγ的能力明顯優(yōu)于CIK單獨(dú)培養(yǎng)，CIK殺傷功能檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)的殺傷能力優(yōu)于CIK單獨(dú)培養(yǎng)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC與CIK混合培養(yǎng)是提高CIK免疫功能的較佳方案。

以上研究提示將HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC與CIK混合培養(yǎng)后自體回輸可能是治療慢性乙型肝炎有效的措施，既具備特異性和持久的免疫應(yīng)答效果，又具有廣泛的非特異性免疫應(yīng)答能力。當(dāng)然，體外細(xì)胞的功能并不能完全替代細(xì)胞回輸機(jī)體后的免疫功能表現(xiàn)，對(duì)臨床的療效還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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引證本文：WANG SY, LIN TF, ZHU LL, et al. Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAg[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1280-1283. (in Chinese) 王少揚(yáng), 林濤發(fā), 朱玲玲, 等. HBsAg和HBcAg聯(lián)合負(fù)載DC與CIK共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立和功能評(píng)估[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(7): 1280-1283.

(本文編輯：王亞南)

Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAgWANGShaoyang,LINTaofa,ZHULingling,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommand,Fuzhou350003,China)

Objective To investigate the function of cytokine-induced killer cell (CIK) after co-culture of dendritic cells (DC) and CIK loaded with different HBV antigens. Methods A total of 13 patients with chronic hepatitis B (CHB) who visited Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command from January 2015 to June 2016 were enrolled. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 13 CHB patients, and DC and CIK were cultured and divided into CIK culture group, DC+CIK co-culture group, DC+CIK+HBsAg co-culture group, DC+CIK+HBcAg co-culture group, and DC+CIK+HBsAg+HBcAg co-culture group. Then ELISPOT assay was performed to measure the ability of CIK to produce pegylated interferonγ (IFNγ), and HepG2.2.15 cells were used as target cells to measure the killing function of CIK. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous date between groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between any two groups. Results There was a significant difference in IFNγ level between different CIK test groups (F=29.84,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest IFNγ level. There was a significant difference in CIK killing rate between groups (F=14.77,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest CIK killing rate. Conclusion DC-CIK co-culture with combined loading of HBsAg and HBcAg may be an effective cell system for the treatment of CHB.

hepatitis B, chronic; hepatitis B surface antigen s; hepatitis B core antigens; dendritic cells; kill cells

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.015

2017-01-24；

2017-02-14。

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Y0073)

王少揚(yáng)(1969-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事病毒性肝炎防治的臨床和基礎(chǔ)研究。

R512.62

A

1001-5256(2017)07-1280-04