鉤吻素子在人和豬、大鼠、猴、犬肝微粒體的酶促動力學及CYP450酶亞型分析

魏文增，黃慧玲，葉麗香， 林 菁,， 俞昌喜

鉤吻素子在人和豬、大鼠、猴、犬肝微粒體的酶促動力學及CYP450酶亞型分析

魏文增1,2，黃慧玲1，葉麗香3， 林 菁1,3， 俞昌喜1

目的 研究和比較鉤吻素子(KM)在人與各種實驗動物肝微粒體體外代謝的酶促動力學及選擇性CYP450酶抑制劑對其代謝的影響。 方法 采用優(yōu)化的反應體系和UPLC檢測方法，測定系列濃度的KM與各種屬肝微粒體孵育的降解曲線，以底物消除法計算酶動力學參數(shù)；共孵育方法考察選擇性CYP450酶抑制劑對KM在各種屬肝微粒體代謝的影響。 結(jié)果 在人肝微粒體，KM的米氏常數(shù)(Km)、最大反應速率(Vmax)、半哀期(T1/2)、固有清除率(CLint)分別為(0.135±0.067)mmol/L、(1.89±0.19)μmol·min-1·g-1pro、(712±23)min和(15.7±5.2)mL·min-1·g-1pro。與人相比，犬、豬的Km值較大，大鼠及猴的CLint較高，4種實驗動物的Vmax值均較大、T1/2均較短。酮康唑在各種屬均可顯著抑制KM代謝，在人、豬、犬IC50<1 μmol/L，在大鼠、猴IC50為1～10 μmol/L，可見CYP3A為主要代謝酶。噻氯匹定、奎尼丁和磺胺苯吡唑僅對大鼠，噻氯匹定僅對猴和犬的KM代謝為弱抑制(抑制率20.43%～44.31%)，說明在體情況下，CYP2B、CYP2D和CYP2C與KM的代謝可能無關(guān)。 結(jié)論 KM在人與豬、大鼠、犬、猴肝微粒體中的主要代謝途徑相同，均由CYP3A酶催化，但酶活性和代謝動力學特征有一定差異。

鉤吻； 鉤吻堿； 微粒體，肝； 色譜法，高壓液相； 催化作用； 酶抑制劑

鉤吻素子(koumine，KM)為鉤吻中含量最高的一種假吲哚型生物堿。據(jù)報道,KM具有高效低毒的鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗腫瘤、抗應激等藥理作用[1-2]。近年來本課題組對KM進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)其還具有較強的治療慢性神經(jīng)疼痛、類風濕性關(guān)節(jié)炎等作用，具有創(chuàng)制新藥的潛能[3-6]。前期研究顯示，KM可在肝微粒體代謝，其在不同實驗動物種屬肝微粒體的主要代謝產(chǎn)物相同，但代謝特征及次要代謝產(chǎn)物構(gòu)成具有一定的差異[6]。為探討和比較KM在人與各種動物代謝的差異情況，本研究采用KM的鹽酸鹽(分子式為C20H22N2O·HCl，圖1)，應用UPLC法測定其在肝微粒體孵育系統(tǒng)的代謝變化，并研究CYP酶特異性抑制劑對代謝的影響，判斷和比較KM在人與4種實驗動物肝微粒體的酶動力學特征和代謝酶亞型，為該藥的進一步研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品、試劑和主要儀器 KM鹽酸鹽(批號201310，純度99.0%，福建醫(yī)科大學藥學院提供)，以PBS溶解，配制成100或5 g/L的母液，分別用于方法學驗證和肝微粒體孵育試驗。PBS粉末(每包2 L，pH為7.2～7.4)及NADPH粉末(北京索萊寶科技有限公司)，PBS以超純水溶解，NADPH以PBS溶解配制成10 mmol/L的溶液。酮康唑(批號531F01)、噻氯匹定(批號058K1300)、磺胺苯吡唑(批號096K1462)及奎尼丁(批號066K2509)(美國Sigma公司)，分別以甲醇溶解配制成合適濃度的溶液；乙腈和甲醇為色譜純(德國默克公司)；人、小型豬、SD大鼠、恒河猴及比格犬肝微粒體(蛋白含量20 g/L)(瑞德肝臟疾病研究上海有限公司)，-80 ℃保存。UPLC(Agilent 1290，美國Agilent公司)；精密天平(BT 25 S，精密度0.01 mg，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；pH計(ORION 3 STAR，賽默飛世爾科技有限公司)；自動氮氣濃縮儀(HAC-I，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

圖1 鉤吻素子鹽酸鹽結(jié)構(gòu)Fig 1 The structure of koumine hydrochloride

1.2 方法

1.2.1 分析和反應條件 KM及其代謝產(chǎn)物的UPLC分析、肝微粒體共孵育反應體系采用本實驗室建立的條件進行[7]：安捷倫Poroshell HPH-C18液相色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，檢測波長256 nm，建立色譜條件，方法學考察顯示日內(nèi)精密度及日間精密度良好，RSD分別<2.42%和<3.61%，回收率>90%。KM保留時間為4.01 min，各種屬的主要代謝物相同，保留時間為1.85 min。

孵育反應體系及其優(yōu)化：肝微粒體5 μL、KM 10 μL、PBS補足至終體積200 μL，于EP管置37 ℃恒溫振蕩箱中預孵育5 min后，再加入預孵育的NADPH溶液(1 mmol/L，20 μL)啟動反應，繼續(xù)孵育一定時間后取出，立即加入4倍體積的冰乙腈溶液終止反應并沉淀蛋白；溫孵液采用700 μL冰乙腈萃取2次，置氮氣濃縮儀揮干后，加入100 μL 25%乙腈復溶，取上清進樣。反應體系優(yōu)化結(jié)果：肝微粒體蛋白濃度0.5 g/L，KM濃度0.73 mmol/L，孵育時間為人和豬4 h、大鼠和犬3 h、猴2 h。

標準曲線：在滅活溫孵液(將肝微粒體水浴100 ℃加熱10 min滅活，蛋白濃度0.5 g/L)中加入系列濃度的KM溶液，進行樣品處理和進樣測定，以KM峰面積對濃度進行線性回歸，實驗過程所有隨行標準曲線在0.012～7.31 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 KM代謝及酶動力學數(shù)據(jù)分析 根據(jù)優(yōu)化反應條件，肝微粒體濃度為0.5 g/L，測定不同濃度KM在各種屬肝微粒體反應體系中隨孵育時間的濃度變化。KM為0.15，0.29，0.73，1.83，3.65 mmol/L，孵育時間0.25，0.5，1，1.5，2，3，4 h(末次：人和豬4 h，大鼠和犬3 h，猴2 h)，每個濃度各個時間點設3復管。孵育樣品處理后進行UPLC測定，根據(jù)隨行標準曲線計算各時間點KM濃度，按照底物消除法[8]，以每個試驗濃度0時間點的底物濃度測值為100%，按方程(1)以其他時間點的底物濃度測值與該值的比值(剩余底物水平)的自然對數(shù)值對反應時間作圖，計算初始線段斜率即為相應底物濃度下的消耗常數(shù)(kdep)，再根據(jù)方程(2)以不同底物濃度的kdep值的倒數(shù)對底物濃度作圖，進行倒數(shù)法直線回歸，計算米氏常數(shù)(Km)、最大反應速率(Vmax)和半衰期(T1/2)。

[S]=[S]0·e-kdep·t

(1)

(2)

1.2.3 CYP450酶抑制試驗 在KM-肝微粒體溫孵體系中分別加入特異性抑制劑，酮康唑終濃度0.32，0.8，2，5，12.5，31.25 μmol/L，奎尼丁、磺胺苯吡唑和噻氯匹定終濃度8，20，50，125，312.5 μmol/L，設3復管，按優(yōu)化的反應條件處理，測定KM主要代謝產(chǎn)物(保留時間為1.85 min)的峰面積，計算抑制率及IC50，評價不同抑制劑對各種屬代謝物生成的影響。抑制率的計算公式如下，將抑制率對抑制劑濃度對數(shù)值作線性回歸計算IC50。

以抑制劑對酶的抑制率判斷，在抑制劑濃度為50 μmol/L時，抑制率<20%為無抑制，抑制率20%～50%和>50%分別為可能抑制和較強抑制[9]，進一步測定IC50。根據(jù)CYP450酶抑制劑強度分級規(guī)則[10]，IC50<1 μmol/L為強抑制；IC50>10 μmol/L為弱抑制，在臨床上不太可能抑制CYP450酶活性；IC501～10 μmol/L為中等抑制作用，其抑制作用需經(jīng)過體內(nèi)的驗證。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用 Windows Excel Microcal Origin 8.5與SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié) 果

2.1 KM酶動力學參數(shù)測定 根據(jù)不同濃度KM在各種屬肝微粒體反應體系的代謝隨孵育時間的濃度變化曲線(圖2A～E)，計算相應底物濃度下的kdep，可見kdep值表現(xiàn)為濃度依賴關(guān)系，再以不同底物濃度的kdep值的倒數(shù)對底物濃度作圖，進行倒數(shù)法直線回歸，計算Km、Vmax和T1/2，結(jié)果見表1。回歸方程分別為(圖2F)：

y=18.139 4x+2.756 2,r=0.991 4 (HLM)

y=4.328 0x+4.596 4,r=0.939 7 (PLM)

y=2.391 8x+0.435 1,r=0.997 2 (RLM)

y=4.192 4x-0.198 6,r=0.998 6(MLM)

y=0.773 3x+1.736,r=0.812 6 (DLM)

(HLM,PLM,RLM,MLM,DLM分別為人、豬、大鼠、猴、犬肝微粒體)

2.2 CYP450酶抑制劑對KM代謝的影響 31.25 μmol/L的酮康唑可顯著抑制KM在人和各種屬微粒體的代謝，抑制率78.31%～95.76%(圖3)。不同濃度下進一步試驗顯示，KM為0.73 mmol/L時，酮康唑在人為強抑制(IC50<1 μmol/L)，在豬、大鼠、猴、犬為中等抑制(IC50為1～10 μmol/L)，低濃度KM(0.15 mmol/L)下酮康唑的抑制作用更顯著(表2)。

在抑制劑濃度為50 μmol/L下，噻氯匹定、奎尼丁和磺胺苯吡唑僅見對大鼠、噻氯匹定僅對猴和犬的KM體外代謝抑制程度為20.43%～44.31%，IC50均高于10 μmol/L(圖3B～D)。

鉤吻素子濃度(mmol/L，A～E)：0.15 0.29 0.73 1.83 3.65. HLM，PLM，RLM，MLM，DLM：分別為人、豬、大鼠、猴、犬肝微粒體.圖2 剩余底物水平-時間曲線(A～E)及倒數(shù)作圖法(F)Fig 2 Percentage of remaining substrate-time curves (A～E)and reciprocal plot(F)

肝微粒體HLM PLM RLM MLM DLM Km/(mmol·L-1)0．135±0．0670．556±0．188☆0．089±0．0150．045±0．0150．673±0．042☆☆☆Vmax/(μmol·min-1·g-1pro)1．89±0．195．69±1．13☆☆12．65±0．47☆☆☆ 9．44±1．26☆☆☆19．16±1．14☆☆☆T1/2/min712±23 362±38☆☆ 136±7☆☆120±11☆☆☆ 150±10☆☆☆CLint/(mL·min-1·g-1pro)15．7±5．210．6±1．7144．1±18．1☆☆230．1±95．6☆ 28．5±0．3

HLM，PLM，RLM，MLM，DLM：分別為人、豬、大鼠、猴、犬肝微粒體. 與HLM比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001.

分別為人、豬、大鼠、猴、犬肝微粒體；鉤吻素子濃度為0.73 mmol/L.圖3 不同抑制劑對鉤吻素子體外代謝的影響Fig 3 In vitro metabolic inhibition of koumine by different inhibitors

c鉤吻素子/(mmol·L-1)IC50/(μmol·L-1)HLM PLM RLM MLM DLM 3．651．98±0．24▲▲1．74±0．11▲▲14．57±0．26▲5．31±0．05▲▲3．78±0．34▲▲0．730．73±0．09▲▲▲1．28±0．05▲▲5．99±0．13▲▲2．46±0．16▲▲1．25±0．05▲▲0．15 <1．0▲▲▲0．55±0．12▲▲▲3．84±0．09▲▲3．90±0．42▲▲0．76±0．06▲▲▲

HLM，PLM，RLM，MLM，DLM：分別為人、豬、大鼠、猴、犬肝微粒體. ▲：弱抑制； ▲▲：中等強度抑制； ▲▲▲：強抑制.

3 討 論

在新藥研究的初期階段，明確藥物代謝特征、途徑以及參與的代謝酶等，對于臨床前和臨床試驗的合理設計以及預測藥物間的相互作用有著重要的意義。CYP450酶的測定、誘導或抑制作用研究為國際上新藥篩選及代謝研究所必須進行的新藥臨床前研究。本研究參照我國CFDA及美國FDA的相關(guān)指導原則[11-12]，對KM酶促動力學及CYP酶抑制劑的影響進行研究。

底物消除法是CYP酶促動力學研究的常用方法，通過測定藥物代謝的酶動力學參數(shù)，可預測藥物在體內(nèi)代謝的動力學特征[7]。李彧和邢曉丹等對大鼠肝微粒體中KM的酶促反應動力學測定，其結(jié)果差異較大[13-14]。本研究比較KM在人和多種實驗動物的研究結(jié)果，可見猴的Km值最小，即KM與猴的親和力最大，與大鼠、人的親和力居中，與豬、犬的親和力較小；比較Vmax、T1/2和CLint值可見，KM在人、豬的代謝較慢、肝清除率較低，在猴、大鼠、犬的代謝較快、肝清除率較高。表明KM在人與不同實驗動物種屬肝微粒體中的酶促反應動力學特征差異較明顯，在應用實驗動物進行體內(nèi)外代謝研究時，應考慮其與人之間的相似性和差異的存在。

在P450超家族中，CYP1、CYP2和CYP3家族約占肝P450含量的70%，介導大多數(shù)藥物的代謝，其中CYP3A介導>50%藥物的代謝。人類CYP3A家族以CYP3A4、3A5為最重要的藥物轉(zhuǎn)化酶，在動物中的主要同工酶分別是CYP3A29(小型豬)、CYP3A1(大鼠)、CYP3A8(猴)和CYP3A12(犬)[15-17]。酮康唑為CYP3A酶特異性抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)其顯著抑制KM在人和各動物種屬肝微粒體的代謝，具有明顯的抑制劑濃度依賴性，且在不同種屬中抑制強弱有一定差異，其中在人抑制作用最強，豬和犬次之，在大鼠和猴為中等程度抑制，據(jù)此推斷KM的代謝可能主要通過CYP3A酶所介導的氧化、脫甲基、羥化等途徑[12]，與噻氯匹定、奎尼丁和磺胺苯吡唑相關(guān)的CYP2B、CYP2D和CYP2C酶可能無關(guān)。最近Hu等也指出，KM在人肝微粒體系通過CYP3A4/3A5介導脫甲基、脫甲基-脫氫、氧化代謝[18]。

本研究通過探討和比較KM在人與常用實驗動物種屬肝微粒體的代謝途徑和動力學特征，表明各動物種屬中KM的主要代謝酶與人一致，但代謝動力學特征在人與各種動物以及動物之間存在較明顯的差異，CYP450酶活性可能也存在一定的種屬差異。

(致謝：感謝臺灣嘉南藥理大學生物科技系高毓瑩助理教授對開展本研究的建議以及對論文的斧正。)

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(編輯：何佳鳳)

Metabolism Kinetics and Subtype Analysis of CYP450 of Koumine in Liver Microsomes of Human, Minipig, Rat, Monkey and Dog

WEI Wenzeng1,2, HUANG Huiling1, YE Lixiang3, LIN Jing1,3, YU Changxi1

1.College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China;2.Fujian Institute of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China;3.Fujian Center for Safety Evaluation of New Drug, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To study the enzyme kinetics and the effects of selective CYP450 enzyme inhibitors on the koumine metabolism in liver microsomes of human, pig, rat, monkey and dog. Methods Koumine in liver microsome was quantified through UPLC. Based on substrate deletion approach, various concentrations of koumine were incubated with liver microsomes under optimized condition, and residual substrate concentrations were measured at different incubating time. Enzymatic kinetic parameters were calculated by reciprocal plot. Influence of four selective inhibitors on koumine metabolism was investigated to identify the enzyme subtypes of the metabolism. ResultsKm,Vmax,T1/2andCLintof koumine in human liver microsomes were (0.135±0.067) mmol/L, (1.89±0.19)μmol·min-1·g-1pro, (712±23)min and (15.7±5.2)mL·min-1·g-1pro, respectively. The parameters in liver microsomes of the four specie animals were observed differences from human in varying degrees, such as:Kmwere higher in dog and pig;CLintwere higher in rat and monkey;Vmaxwere higher andT1/2were smaller among four specie animals. Ketoconazole significantly inhibited the koumine metabolism in liver microsomes from human, pig, dog(IC50<1 μmol/L)and rat, monkey (IC50between 1 and 10 μmol/L), indicating that CYP3A is the major enzyme of koumine metabolism in these speciesinvitro. The inhibitory ratio of ticlopidine, quinidine and sulfaphenazole to the koumine metabolism in rat, ticlopidine in monkey or dog, were 20.43%～44.31% (IC50>10 μmol/L), and no other inhibitory effects were observed by ticlopidine, quinidine and sulfaphenazole. Thus CYP2B, CYP2D and CYP2C are unlikely to participate koumine metabolisminvivo. Conclusion The major metabolic pathway of koumine is similar in the liver microsomes among five species, and CYP3A is the major metabolic enzymesinvitro. However, there are some differences among the various species in enzyme kinetic characters and enzyme activity of koumine metabolism.

Gelsemium elegans; Gelsemine; microsomes, liver; chromatography, high pressure liquid; catalysis; enzyme inhibitors

2016-10-13

福建省科技計劃重點項目(2013Y0088)

1. 福建醫(yī)科大學 藥學院，福州 350122； 2. 福建省中醫(yī)藥研究院，福州 350003; 3. 福建醫(yī)科大學 福建省新藥安全性評價中心，福州 350122

魏文增，男，研究實習員，醫(yī)學碩士

林 菁. Email: yq509@163.com

R284.1； R345； R446

A

1672-4194(2017)02-0082-06