杠板歸總黃酮纖維素酶提取工藝的研究

薛天樂，孫 鵬，王 慶，丁 銳

亳州職業技術學院藥學院，亳州，236800

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杠板歸總黃酮纖維素酶提取工藝的研究

薛天樂，孫 鵬，王 慶，丁 銳

亳州職業技術學院藥學院，亳州，236800

[目的]:研究杠板歸總黃酮的纖維素酶最優提取工藝。[方法]:分別考察酶濃度、提取時間、pH值、提取溫度、料液比、乙醇濃度對杠板歸總黃酮提取率的影響，并結合正交試驗研究最優提取工藝。[結果]:最優工藝為酶濃度2 mg/mL，提取時間為30 min，pH5.5，反應溫度65℃，液料比為40∶1，乙醇濃度為50%，在此工藝條件下，總黃酮提取率可達3.28%，比傳統的水煎法和乙醇回流法分別提高了91.8%和44.5%。[結論]：此法可以用于杠板歸總黃酮的提取。

杠板歸；總黃酮；纖維素酶；正交試驗

蓼科植物杠板歸(PolygonumperfoliatumL.)為多年生蔓性草本，分布范圍較廣[1],具有清熱解毒、利水消腫、止咳等功效，臨床上常用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿少、濕熱瀉痢、濕疹、癤腫、蛇蟲咬傷的治療[2]。有研究表明，杠板歸中黃酮類化合物的含量較高[3]，具有保護肝臟的作用[4-5]。目前，關于杠板歸總黃酮提取方面的報道不多[6-7]，為此，本文采用單因素和正交試驗相結合的方法，優選杠板歸總黃酮纖維素酶提取工藝，旨在為杠板歸的開發應用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材 料

杠板歸(購自安徽省亳州市三義堂藥業有限公司)，蕓香苷對照品(購自中國藥品生物制品檢定所)，纖維素酶(購自湖南米純生物科技有限責任公司，酶活力為10萬U/g)，其他試劑皆為分析純。

1.2 儀 器

V5800型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，DFY-300型搖擺式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，AUY-200型分析天平(津島國際貿易有限公司)，循環式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)，HH-4型恒溫水浴鍋(金壇市宏華儀器公司)，RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制

準確稱取5.5 mg蕓香苷標準品，70%乙醇定容至50 mL的量瓶中，制成濃度為0.11 mg·mL-1的蕓香苷標準液。準確吸取蕓香苷標準溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL置于6支25 mL量瓶中，分別向每個量瓶加入1.0 mL 5% 亞硝酸鈉溶液，混合均勻，靜置6 min，再加入1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，靜置6 min；加入10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液、70%乙醇定容，10 min后在510 nm波長處測定吸光度。以相應的吸光度為縱坐標，蕓香苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線，蕓香苷在濃度為8.8～44 μg·mL-1之間具有良好的線性(R2=0.9993)，曲線方程為：y=11.74x+0.0705。

2.2 總黃酮的提取與含量測定

將杠板歸粗粉1.0 g置于具塞錐形瓶中，按試驗設計，以不同的條件進行提取，同法提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，70%的乙醇定容至50 mL的量瓶中，取5.0 mL置于25 mL量瓶中，按“2.1”方法測定吸光度，并根據回歸方程計算濃度，從而求得提取率。

總黃酮的提取率(%)=C×V×10-3/m×100%

式中，C為總黃酮的濃度mg/mL，V為溶液體積mL，m為稱取的杠板歸的質量g。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取溫度

控制液料比(mL/g)為30∶1，乙醇濃度為60%，酶用量為1 mg/mL，pH為4，提取時間為60 min，溫度分別為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

由圖1可知，提取率隨著提取溫度的升高表現出先增高后降低的趨勢。這是因為隨著溫度的升高，纖維素酶的活性逐漸增強，但當溫度超過55℃以后，纖維素酶開始失活，提取率也隨之下降。

圖1 提取溫度的考察

2.3.2 提取時間

控制液料比(mL·g-1)為30∶1，乙醇濃度為60%，酶用量為1 mg·mL-1，pH為4，提取時間分別為30、60、90 、120、150 min，提取溫度為55℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

由圖2可知，隨著提取時間的增加，總黃酮的提取率也增大，當提取時間達到60 min時，總黃酮的提取率達到最高。再繼續增加反應時間，受熱破壞而損失的總黃酮量也增加，提取率反而降低[8]。

圖2 提取時間的考察

2.3.3 酶濃度

控制液料比(mL/g)為30 ∶1，乙醇濃度為60%，酶用量分別為1、1.5、2、2.5、3 mg·mL-1，pH為4，提取時間為60 min，提取溫度為55℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

由圖3知，總黃酮的提取率隨著纖維素酶濃度的增加而逐漸上升，當酶濃度達到2 mg·mL-1以上時，繼續增加酶濃度，沒有多余的底物與之結合，總黃酮的提取率不再上升。

圖3 纖維素酶用量的考察

2.3.4 液料比

控制液料比(mL/g)分別20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，乙醇濃度為60%，纖維素酶用量為2 mg·mL-1，pH為4，提取時間為60 min，提取溫度55℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

由圖4可知，總黃酮的提取率隨著料液比增加而增加，當料液比達到40∶1以上時，總黃酮的提取率不再增加。

圖4 料液比的考察

2.3.5 乙醇濃度

控制液料比(mL/g)為40∶1，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%，纖維素酶用量為2 mg·mL-1，pH為4，提取時間為60 min，提取溫度55℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

圖5 乙醇濃度的考察

由圖5知，提取率隨乙醇濃度增加表現出先增加后降低的趨勢，乙醇濃度為50%時提取率最大。這可能是乙醇濃度過高，一方面抑制了纖維素酶的部分活性，另一方面增加了一些親脂性強的雜質成分的競爭性溶出[9]。

2.3.6 pH值

控制液料比(mL·g-1)為40∶1，乙醇濃度為50%，纖維素酶用量為2 mg/g，pH分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6，提取時間為60 min，提取溫度55℃，按“2.2”方法測定總黃酮提取率。

由圖6知，當pH值增大至5.0左右時，總黃酮的提取率達到最大；再增大pH時，總黃酮的提取率開始降低，因此較為適宜的提取pH值為5.0。

圖6 pH值的考察

2.4 正交實驗

選取酶濃度、提取時間、pH、提取溫度四個因素設計正交實驗，確定杠板歸總黃酮的最佳提取工藝，結果見表1、2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

由表2知，影響杠板歸總黃酮提取率的各影響因素主次順序為酶濃度>提取溫度>pH>提取時間。最佳試驗組合為A2B1C3D3，即酶濃度為2 mg·mL-1，提取時間為30 min，pH值為5.5，反應溫度65℃。

2.5 不同提取方法的比較

采用最佳提取工藝提取杠板歸總黃酮，且與傳統的水煎法和乙醇回流法進行對比，結果見表3。

表3 不同提取方法的結果比較

由表3知，在最佳提取條件下，杠板歸總黃酮的提取率可達3.28%，分別比傳統的水煎法和乙醇回流法提高了91.8%和44.5%。

3 結 論

本文采用單因素和正交試驗相結合的方法，優選杠板歸總黃酮纖維素酶提取工藝，結果表明：在酶濃度為2 mg·mL-1，提取時間為30 min，pH值為5.5，反應溫度65℃，液料比為40∶1，乙醇濃度為50%的最優提取工藝條件下，杠板歸總黃酮的提取率可達3.28%，顯著高于水煎法和乙醇回流法。該工藝可以用于杠板歸總黃酮的提取。

[1]邢煜君,王海燕,王俊霞,等.杠板歸抗氧化作用及抑制α-葡萄糖苷酶活性[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(2):189-191

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京：中國中醫藥科技出版社，2015:166-167

[3]張明,陳華國,趙超,等.杠板歸中總黃酮的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(18):77-80

[4]韋日明,高雅,張可鋒，等.杠板歸總黃酮對小鼠酒精性肝損傷的保護作用[J].南方農業學報,2016,47(4):664-669

[5]高雅,李豪,鐘明利，等.杠板歸總黃酮抗肝纖維化大鼠的作用及其機制研究[J].華西藥學雜志,2015,30(2):181-183

[6]朱良榮,陶鋒.杠板歸總黃酮不同提取工藝的比較研究[J].中國中醫藥科技,2016,23(3):296-298

[7]王希,王宗成.超聲波輔助堿水提取杠板歸中黃酮的工藝研究[J].廣州化工,2016,44(16):57-59

[8]高旗,張竟怡,寧敏敏,等.微波提取陜南名茶中總黃酮的工藝研究[J].河北農業科學,2011(1):154-157

[9]畢潔,于麗娜.花生殼黃酮乙醇提取工藝探討[J].現代化工,2008,28(2):316-319

(責任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.05.033

2017-01-21

安徽省教育廳自然科學重點項目(KJ2016A500)；亳州市中藥科技創新團隊(BZ2013zzb06)。

薛天樂(1981-)，安徽亳州人，講師，碩士，研究方向:中藥活性成分提取與分離。

R284.2

：A

：1673-2006(2017)05-0116-03