脈沖電場對蛋白質與金屬離子螯合作用的影響

湯 婷 劉燕燕 蔣愛民 蔣 卓

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

?

脈沖電場對蛋白質與金屬離子螯合作用的影響

湯 婷 劉燕燕 蔣愛民 蔣 卓

(華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642)

采用拉曼光譜研究脈沖電場對卵清蛋白與金屬離子(Cu2+、Ba2+、Mn2+或 Ca2+)螯合作用的影響。試驗結果表明：① PEF處理時間和金屬離子種類都能影響金屬離子和蛋白質的螯合作用，隨著脈沖時間的延長，金屬離子與卵清蛋白的螯合作用增強，PEF處理時間為1 695 μs時，Mn2+和Cu2+與蛋白質的鰲合開始減弱；② 蛋白質分子和金屬離子在1 200～1 700 cm-1位置出現不同程度的螯合：與Mn2+鰲合最強，Cu2+和Ca2+較弱，Ba2+最弱。

脈沖電場；卵清蛋白；拉曼光譜；金屬離子；螯合作用

脈沖電場(Pulsed Electric Fields，PEF)處理技術是一種新型的食品綠色加工技術[1-2]，能在保持食品風味和營養成分的前提下[3-4]，不可逆破壞微生物的細胞膜結構，殺死病原微生物和腐敗微生物，達到殺菌的目的[5-6]，并在鈍酶、消除農殘、物質提取等方面都有增強效應[7-9]。通過圓二色譜、熒光光譜等方法研究PEF對蛋白質二級結構的影響，已有數據[10-11]表明PEF誘導酪氨酸和色氨酸的構象改變，二硫鍵和疏水基團的暴露，α-螺旋和β-折疊等結構的改變。張芳等[12]研究表明，金屬離子與蛋白質結合后會引起氨基酸殘基周圍的化學環境發生變化，導致這些殘基化學位移發生改變。金屬離子與蛋白質的結合可能是高度專一的、緊密的，也可能是瞬態的、松散的。由于金屬離子與蛋白質結合會導致蛋白質分子結構和功能特性的改變，金屬離子在蛋白質分子結構和生物學功能方面都起著關鍵作用[13]。因此，本研究采用脈沖電場調控金屬離子和蛋白質的結合，從而得到理想的蛋白質分子結構。

拉曼光譜是一項能夠在不破壞生物組織、分子的前提下，對活體生物、細胞以及蛋白水溶液進行光譜采集，進而提供蛋白質二級和三級結構信息的直接分析技術[14-16]。相對于傅立葉紅外轉換光譜和圓二色譜，它能提供更廣泛的結構信息，包括脂肪族氨基酸的C—H基團等氨基酸的側鏈信息。研究表明，通過拉曼光譜研究不同條件對蛋白質變性的影響[17]，還可通過觀察O—H的伸縮變化研究蛋白質和水的相互作用[18]。

本試驗以卵清蛋白(Ovalbumin)為原料，結合相關文獻[19-21]對卵清蛋白的拉曼圖普解析知識，利用拉曼光譜檢測PEF對蛋白質與金屬離子鰲合作用的影響，為脈沖電場在食品中更廣泛的運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白：白蛋白，美國Sigma公司；

脈沖電場處理裝置：SY-Z-500型，華南理工大學食品與食品學院研制；

低溫冷凍液循環泵：DLSK-3/10型，鄭州科泰實驗設備有限公司；

恒流泵：BT100-2J型，英國Longer公司；

數顯電導率儀：DDS-11A型，上海雷磁·創益儀器儀表有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-18N型，寧波新芝生物科技有限公司；

拉曼光譜儀：LabRAM Aramis型，法國H.J.Y公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵清蛋白處理流程 配制10 g/L卵清蛋白溶液，透析12 h后，使電導率低于180 μs/cm，分別以摩爾比1∶3，1∶4，1∶6，1∶4加入Cu2+，Ba2+，Mn2+，Ca2+。在不同脈沖條件下獲得PEF處理樣品，冷凍干燥后，待用。

1.2.2 脈沖電場參數 脈沖寬度20 μs，電場強度20 kV/cm，流速25 mL/min，樣品接受電脈沖處理時間分別為565，1 130，1 695，2 260 μs。

1.2.3 拉曼光譜分析 將處理樣品放在拉曼顯微鏡下，激光波長785 nm，光柵600 grades/cm，激光功率>30 mW，夾縫寬度50～800 μm，掃描范圍100～400 cm-1，掃描時間20 s，積分5次。所有圖片均使用ORIGIN 9.0 繪制處理。

1.3 拉曼光譜中特征波段的指認

蛋白質構象或構型的變化引起拉曼激光的散射程度呈現不同的吸收峰位置、強度和退偏比，從而得到氨基酸側鏈的構象信息及其微環境的變化情況等。拉曼譜圖中不同波段的卵清蛋白分子基團和結構信息見1。

表1 拉曼光譜中特征波段的指認[19-21]

2 結果與分析

2.1 金屬離子對卵清蛋白分子微觀結構的影響

結合圖1和表1，添加金屬離子后，相對空白樣，卵清蛋白的微觀結構改變，金屬離子和卵清蛋白分子在1 700～1 200 cm-1位置存在差異性螯合：添加Mn2+、Cu2+和Ba2+分別在1 700～1 200 cm-1，1 400～1 200 cm-1和1 660 cm-1，1 458 cm-1和1 660 cm-1處出現結構變化，添加Ca2+不存在明顯的結構變化，說明Mn2+鰲合作用最強，Ba2+和Cu2+次之，Ca2+最弱。

金屬離子(Mn2+、Ba2+、Cu2+、Ca2+)的加入，引起760 cm-1和840 cm-1吸收峰變化，表明金屬離子引起色氨酸和酪氨酸殘基基團狀態改變，說明蛋白質分子微環境變化；而995，1 458，1 660 cm-1附近峰峰強增強，說明金屬離子影響卵清蛋白分子中的無規則卷曲結構，脂肪酸側鏈C—H彎曲和酰胺Ⅰ帶無規則結構，蛋白質分子極性環境增強。3 000～2 800 cm-1波段的吸收峰發生變化，加入Ca2+，吸收峰強度峰強減?。患尤隡n2+、Ba2+和Cu2+，吸收峰強度增加，說明金屬離子影響卵清蛋白分子中脂肪族側鏈C—H伸縮，Ca2+誘導其微環境極性減小，Mn2+、Ba2+和Cu2+誘導其微環境極性增強。

圖1 金屬離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.2 脈沖電場對添加Ca2+的卵清蛋白分子微觀結構的影響

由圖2和表1可知，對比未經PEF處理的加Ca2+的卵清蛋白圖譜，隨著處理時間的延長，1 672 cm-1處吸收峰向低波段遷移至1 660 cm-1，且峰強明顯增強，說明PEF能量的輸入引起卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶β-折疊減少，無規則結構增多，蛋白質分子展開增強；1 454 cm-1吸收峰峰強增強，說明PFF誘導脂肪族側鏈C—H彎曲，微環境極性增強；1 400～1 200 cm-1波段的吸收峰峰強增強，說明PEF引起C—H平面彎曲和C—N伸縮增強，蛋白質分子微環境極性改變，即PEF誘導Ca2+和蛋白質分子在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強。

同時，PEF處理誘導在541，763，946 cm-1峰強度增強，說明PEF引起蛋白質分子脂肪族側鏈構象和色氨酸周圍環境改變，以及無規則卷曲結構增多；對于2 800～3 050 cm-1波段的峰，隨著脈沖處理時間的延長，2 970 cm-1附近峰峰形更趨均一單峰，說明PEF引起脂肪族側鏈C—H伸縮振動，微環境極性增強[1]。

圖2 PEF協同Ca2+影響卵清蛋白分子Raman圖

2.3 脈沖電場對添加Cu2+的卵清蛋白分子微觀結構的影響

經PEF處理后，添加Cu2+的卵清蛋白分子得到拉曼光譜圖見圖3，在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強。隨著PEF處理時間延長，1 400～1 200 cm-1波段吸收峰強度增強，其中1 260 cm-1吸收峰向低波段遷移，且峰強增加，說明PEF誘導卵清蛋白分子酰胺Ⅲ帶結構變化，α-螺旋結構減少，無規則結構增多；1 596 cm-1開始出現吸收峰，其峰強隨處理時間延長而增大，說明PEF增強了C—H伸縮和N—H變形振動；1 660 cm-1峰強增大，說明PEF誘導酰胺Ⅰ帶無規則結構增多。

同時在500，775，960，1 450 cm-1峰強先增加后降低(在處理時間為1 695 μs時開始降低)，說明PEF誘導卵清蛋白分子中脂肪族側鏈的構象變化，色氨酸包埋殘基、無規則卷曲結構先增加后減少，蛋白分子的微環境極性先增強后減弱，1 695 μs時蛋白質開始變性。850，830 cm-1代表酪氨酸酚羥基及酪氨酸的狀態，I850/I830用來指示酚羥基基團的氫鍵以及酪氨酸包埋或暴露的狀態。I850/I830增大，說明PEF誘導賴氨酸酚羥基基團氫鍵增多，酪氨酸被包埋程度增加；2 957 cm-1處的明顯吸收峰逐漸變為多個小雜峰，說明PEF影響脂肪族側鏈C—H伸縮振動，微環境極性減弱。

圖3 PEF協同Cu2+離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.4 脈沖電場對添加Ba2+的卵清蛋白分子微觀結構的影響

結合圖4和表1，隨著脈沖電場處理時間延長，添加Ba2+的卵清蛋白結構發生變化：1 600 cm-1峰消失，說明PEF誘導C—H伸縮振動和N—H變形振動變化，酰胺Ⅰ帶結構變化；1 660 cm-1峰強先增大后減小，可能是PEF先打亂卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶結構，然后誘導無規則結構增加；同時，1 400～1 200 cm-1波段吸收強度逐漸增大，其中1 260 cm-1處吸收峰增大，說明PEF引起卵清蛋白分子酰胺Ⅲ帶結構變化，α-螺旋增加；結果表明PEF誘導添加Ba2+的卵清蛋白分子展開減少，即Ba2+和蛋白質分子在1 700～1 200 cm-1位置螯合增強。

753 cm-1峰強增大，說明卵清蛋白分子中色氨酸側鏈殘基暴露程度，以及對微環境的敏感性增強；經PEF處理后，945 cm-1吸收峰消失，當PEF處理時間達到2 260 μs時，吸收峰又重新出現，且峰強增大，說明短時間電脈沖處理會使卵清蛋白分子中無規則卷曲結構展開，當處理時間達到一定時，會影響其C—C骨架振動，重新形成無規則卷曲結構；同時，未進行PEF處理的卵清蛋白在3 000～2 800 cm-1波段為多個小雜峰，經PEF處理后的在3 000～2 800 cm-1波段的吸收峰逐漸趨于單峰，最終在2 931 cm-1處形成均一單峰，說明PEF引起脂肪族側鏈C—H伸縮振動，微環境極性增強[1]。

圖4 PEF協同Ba2+離子影響卵清蛋白分子Raman圖

2.5 脈沖電場對添加Mn2+的卵清蛋白分子微觀結構的影響

結合表1，由圖5可知，PEF在1 700～1 200 cm-1對Mn2+和蛋白質分子的螯合作用明顯。對比未經PEF處理的Mn2+卵清蛋白，隨著PEF處理時間延長，在1 400～1 200 cm-1波段的吸收強度逐漸減小，說明PEF影響卵清蛋白中C—H平面彎曲振動和C—N伸縮振動，結果表明PEF誘導添加Mn2+的卵清蛋白分子展開減少，即PEF誘導Mn2+和蛋白質分子在1 400～1 200 cm-1位置螯合減弱，可能是PEF擾亂蛋白質分子結構，影響了與金屬離子的鰲合作用；1 600 cm-1處出現吸收峰，說明PEF引起卵清蛋白中酰胺鍵C═O伸縮，即PEF誘導Mn2+和蛋白質分子在1 600 cm-1螯合作用增強；1 660 cm-1處吸收峰隨PEF處理時間延長而變化，說明565 μs時卵清蛋白分子中酰胺Ⅰ帶結構被打亂，經PEF進一步處理，其無規則結構開始增多，處理1 695 μs后蛋白可能發生變性，無規則結構減少并保持穩定狀態。

515，750 cm-1的吸收峰峰強逐漸增強，說明PEF誘導卵清蛋白分子中S—S伸縮變化，脂肪族側鏈的構象變化，色氨酸的包埋殘基減少，酰胺Ⅰ帶無規則結構減少，對微環境的敏感程度減弱；946 cm-1處峰的位置和吸收強度均隨處理時間發生變化，說明PEF誘導卵清蛋白分子中C—C骨架振動變化，無規則卷曲結構改變；2 910 cm-1處的強吸收峰逐漸變為多個小雜峰，說明PEF影響脂肪族側鏈C—H伸縮振動，微環境極性改變。

圖5 PEF協同Mn2+影響卵清蛋白分子Raman圖

3 結論

經過大量試驗證明，金屬離子過量會導致蛋白質變性。卵清蛋白和金屬離子主要在1 700～1 200 cm-1波段具有鰲合作用，且不同金屬對卵清蛋白微觀結構的影響不同，其中，Mn2+影響最大，Ca2+影響最小，可能與電子層數和電子云密度有關。

PEF對金屬離子和卵清蛋白鰲合作用的影響主要表現在加強1 700～1 200 cm-1波段吸收峰峰強。金屬離子不同，影響程度也不同。其中，Mn2+影響最大，Ba2+最小，可能是由電子云密度造成的，Ba2+電子云密度最大，PEF穿透最難，導致蛋白質結構變化最小，因而對鰲合作用造成的影響最小。PEF處理時間對金屬離子和卵清蛋白的鰲合作用也會造成影響，整體而言，處理時間與加強鰲合程度呈正相關，但不同金屬離子影響不同。

[1] LIU Yan-yan, ZHANG Ying, ZENG Xin-an, et al. Effect of Pulsed Electric Field on Microstructure of Some Amino Acid Group of Soy Protein Isolates[J]. International Journal of Food Engineering, 2014, 10(1): 113-120.

[2] 曾新安, 資智洪, 楊連生. 高強脈沖電場對食品成分的影響[J]. 食品工業科技, 2008, 29(12): 256-259.

[3] ZHAO Wei, TANG Ya-li, LU Li-xin, et al. Review: Pulsed Electric Fields Processing of Protein-Based Foods[J]. Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(1): 114-125.

[4] 顏文旭, 張姍姍, 公群. 高壓脈沖電場殺菌多物理場特性研究[J]. 食品與機械, 2016, 32(2): 1-6.

[5] ZHANG Qing-hua, BARBOSACANOVAS G V, SWANSON B G. Engineering aspects of pulsed electric-field pasteurization[J]. Journal of Food Engineering, 1995, 25: 261-281.

[6] 夏濤, 吳云峰, 王勝利, 等. 高壓脈沖電場殺菌系統中高壓脈沖發生器研究進展[J]. 食品與機械, 2016, 32(5): 229-231.

[7] 曾新安, 劉燕燕, 李云, 等. 高強脈沖電場和熱處理對橙汁維生素C影響比較[J]. 食品工業科技, 2009, 30(6): 123-124.

[8] 趙偉, 楊瑞金, 張文斌, 等. 高壓脈沖電場對食品中微生物、酶及組分影響的研究進展[J]. 食品與機械，2010, 26(3): 153-157.

[9] 盧沿鋼, 董全. 高壓脈沖電場提取食品中天然產物的研究進展[J]. 食品與機械, 2012, 28(1): 243-246.

[10] 李樂軍. 熒光光譜與激光拉曼光譜研究脈沖電場對蛋白質構象的影響[D]. 上海: 華東師范大學, 2005: 1-3.

[11] 賈曉, 曾新安. 拉曼光譜研究脈沖電場作用下磷脂脂質體構象的變化[J]. 食品工業科技, 2012, 33(5): 138-140.

[12] 張芳, 林東海. 用核磁共振方法研究金屬離子與蛋白質的相互作用[J]. 波譜學雜志, 2009, 26(1): 136-149.

[13] 劉西海. 金屬離子對蛋清蛋白質結構的影響研究[J]. 中國家禽, 2012, 34(1): 27-31.

[14] 趙南明. 生物物理學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 215-216.

[15] 王中江, 江連洲. 大豆分離蛋白在不同pH下的拉曼光譜分析[J]. 食品工業科技, 2012, 33(11): 65-70.

[16] 孫娟, 張暉, 王立, 等. 基于拉曼光譜的大米快速分類判別方法[J]. 食品與機械, 2016, 32(1): 41-45.

[17] 袁麗, 紀秀, 石彤, 等. 拉曼光譜法分析凡納濱對蝦凍藏過程蛋白質與水分結構變化[J]. 食品科學, 2016, 37(18): 202-207.

[18] HERRERO A M, CARMONA P, GARCIA M L, et al. Ultrastructural changes and structure and mobility of myowater in frozen-stored hake (Merluccius merluccius L.) muscle: relationship with functionality and texture[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(7): 2 558-2 566.

[19] 李樂軍, 陳樹德, 喬登江. 脈沖電場與牛血清白蛋白相互作用的同步熒光光譜和拉曼光譜比較研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2006(1): 81-86.

[20] 黃群, 金永國, 馬美湖, 等. 超高壓處理對S-卵白蛋白構象與功能特性的影響[J]. 農業機械學報, 2013, 44(3): 161-166.

[21] CRAIG W S，GABER B P. Laser Raman scattering from an enzyme of well-documented structure，human carbonic anhydrase B[J]. J. Am. Chem. Soc., 1977, 99(12): 4 130-4 134.

Study on chelating of metal ion and protein in pulsed electric field

TANG Ting LIU Yan-yan JIANG Ai-min JIANG Zhuo

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China)

The effects of pulsed electric field on chelating of ovalbumin and metal ions (Cu2+, Ba2+, Mn2+or Ca2+) and the effect of pulsed electric field on the chelating effect of ovalbumin were studied by Raman spectroscopy. Results: ① PEF treatment time and metal ion species could affect the chelation of metal ions and protein, and the chelation of metal ions with ovalbumin was enhanced with the prolongation of pulse treatment time, when PEF treatment time was 1 695 μs, the chelation of Mn2+and Cu2+with protein began to weaken; ② The protein and metal ions chelated to different degrees at 1 200～1 700 cm-1, the strongest was Mn2+, followed by Cu2+and Ca2+, and the weakest was Ba2+.

pulsed electric fields; Ovalbumin; Raman spectra; metallic ion; chelation

國家自然科學基金(編號：21506069)；廣東省自然科學基金項目(編號：2016A030310455)

湯婷，女，華南農業大學在讀碩士研究生。

2017—03—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.003