耐酸耐膽鹽益生乳酸菌的篩選與鑒定

呂源玲

(江南大學食品學院, 江蘇 無錫 214122)

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耐酸耐膽鹽益生乳酸菌的篩選與鑒定

呂源玲

(江南大學食品學院, 江蘇 無錫 214122)

為了篩選出人源性的耐酸、耐膽鹽的益生菌，利用含膽鹽(0.2%)的5種選擇性培養基(TPY、BHI、MRS、SL、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養基)，以溴甲酚紫為酸性指示劑，從嬰兒糞便中初步篩選出42株耐膽鹽的乳酸菌。根據菌株在pH 5.0，4.0，3.5的MRS液體培養基中培養時OD值的變化情況，篩選出3株具有較好酸耐受性的菌株。然后通過平板菌落計數方法測定篩選出的3株菌在pH 3.0條件下0～3 h存活率的變化情況，篩選出對酸和膽鹽耐受能力最強且最穩定的菌株經16S rDNA分子生物學鑒定為Lactobacillusplantarum。該菌能夠作為潛在的益生菌菌株用于后期深入地挖掘其益生功能。

乳酸菌；耐膽鹽；耐酸；篩選；鑒定

作為人和動物腸道的正常菌群的益生乳酸菌，具有許多益生功效[1]。益生乳酸菌可以抑制腐敗菌生長，提高人體免疫功能，延緩機體衰老，預防心血管疾病，還具有防癌、抗癌等功能[2]。

盡管益生乳酸菌具有很多有利于機體健康的功效，但是攝入益生菌制品并不意味著就可以獲得這些功效。有報道[3]顯示，不同人種的腸道菌群具有較大差異。而目前中國許多企業多以國外的菌種或非人類腸道來源的乳酸菌生產益生菌產品，沒有考慮到不同人群對相同菌株的適應性的差異以及不同來源菌株對人體環境適應性的差異[4]。因此，在產品的開發和菌株的使用上可能存在一些盲點。

本試驗旨在通過體外篩選出適合于亞洲人群的人源性的、對胃酸和膽汁具有一定耐受性的益生乳酸菌。從嬰兒糞便分離獲得大量的乳酸菌，并模擬胃腸道環境篩選出人源性耐酸、耐鹽的益生乳酸菌，具有更加適應亞洲人群腸道環境、安全性高等優點，可以將其制成益生制劑直接應用于人體或應用于乳制品、禽畜飼養、水產養殖等領域，為進一步的乳酸菌生理功能的開發提供菌種資源儲備。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

篩選來源：4名健康的嬰兒，年齡為4～7個月，采樣前1周內未服用過任何抗菌類藥物；

石蕊、溴甲酚紫：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

MRS培養基、乳酸桿菌選擇性培養基：生化試劑，青島科園海博生物技術有限公司；

腦心浸液瓊脂培養基：生化試劑，杭州天和微生物試劑有限公司；

TPY瓊脂培養基：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

酶標儀：imrk型，美國伯樂公司；

隔水式恒溫培養箱：GHP-9160型，上海一恒科技有限公司；

基因擴增儀：Bio-rad S1000型，美國 Bio-Rad 公司；

電子顯微鏡：Quanta200型，美國FEI公司；

厭氧罐：3.380 102 AN AEROBIC型，德國Schutt Labortechnik GmbH公司；

凝膠成像儀：Gel Doc EZ型，美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 取5 g左右樣品加入有玻璃珠的三角瓶中，加入90 mL 0.9 g/mL胰蛋白胨水進行稀釋預處理，以300 r/min的速度振蕩10 min。吸取1 mL糞便原液加入一支裝有9 mL胰蛋白胨水的試管中，振蕩混勻，作為10-1的稀釋液，同樣方法稀釋至10-8。

采用稀釋涂布平板法，將糞便原液及10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀釋度的稀釋液各取200 μL，均勻涂布于已含0.2%牛膽鹽的TPY、BHI、MRS、SL、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養基上。將平板倒置于厭氧罐(厭氧罐中放入含有10 g焦性沒食子酸、25 g NaHCO3、250 mL蒸餾水的燒杯，并經過3次抽真空至-0.08 MPa、充氮氣至0.02 MPa過程)中，放入37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。取出平板觀察其生長情況，并挑出變紅或變黃的菌落，制片并進行革蘭氏染色，將油鏡觀察為紫色的革蘭氏陽性菌在MRS平板上進行反復劃線分離，倒置于厭氧罐中于37 ℃環境培養48 h。取出后挑取單菌落進行制片鏡檢，直至確定其純化[5]。

1.2.2 石蕊牛奶試驗 將純化后的菌進行編號并挑取單菌落將其接種至MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養24～48 h制成菌液。將脫脂乳粉以1∶10 (g/mL)的比例與水混合溶解后，調pH值至7.2，以40∶1(體積比)的比例加入石蕊試劑，此時牛奶呈藍紫色，分裝后于115 ℃，20 min滅菌。以1%體積分數接種供試菌液于石蕊牛奶中，置于厭氧罐中于37 ℃環境培養48 h。取出觀察，將產生凝乳現象并且能使牛奶變為粉紅色的菌株初步確定為乳酸菌[6]。

1.2.3 耐酸試驗 將保存的菌株接入MRS液體培養基中進行活化，并以一定順序將菌液注入96孔板，每孔20 μL，再注入200 μL pH分別為5.0，4.0，3.5的MRS液體培養基，以250 r/min振蕩5 min。置于37 ℃恒溫箱進行厭氧培養，于0，4，6，8 h用酶標儀測量OD值。每個菌株至少做3個平行。使用OD值計算菌株在不同pH值培養基中的增長率：

(1)

式中：

K——菌株增長率，%；

ODx——乳酸菌生長xh在600 nm下OD值；

OD0——乳酸菌生長0 h在600 nm下OD值。

1.2.4 菌株存活率計算 將得到的6株菌接種至MRS液體培養基，于37 ℃環境厭氧培養48 h，得到菌液。按5%體積分數將菌液接種至pH值為3.0的MRS液體培養基(MRS液體培養基經過115 ℃，20 min滅菌后，用濃度為0.1 mol/L的HCl調pH為3.0，分裝試管)，振蕩。在0，1，2，3 h分別取出50 μL菌液至EP管中，加入450 μL 0.9 g/mL胰蛋白胨水進行稀釋，以此類推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀釋度的菌液，每個稀釋度分別取20 μL菌液在MRS平板上進行點種，倒置于厭氧罐中，放入37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，使用平板計數法測定活菌數并計算存活率，平行3次[7]。

(2)

式中：

R——菌株存活率，%；

N1——菌株處理后活菌數，CFU/mL；

N0——菌株初始活菌數，CFU/mL。

1.2.5 16S rDNA擴增方法 乳酸菌DNA的提取按照BIO BASICI INC.生產的基因組DNA提取試劑盒說明書的方法提取染色體DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小是否正確，通過凝膠成像儀確定為乳酸菌后對其基因模塊進行PCR擴增。PCR擴增采用50 μL體系，其中DNA模板1 μL，dNTP 5 μL、Taq酶1 μL、10×buffer 5 μL及基因模板2 μL，采用16S rDNA通用引物P1、P2，即R518(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')和F357GC(5'- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')各1 μL，超純水35 μL 。反應條件為：94 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 100 s進行30個循環，72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的片段大小是否正確[8-9]。將檢驗正確的樣品4 ℃冰箱保存備用。

1.2.6 16S rDNA的序列測定及與標準株序列的比較 將PCR樣品寄至上海華大生物工程有限公司測序，并通過登陸National Center for Biotechnology Information，運用Basic Local Alignment Search Tool軟件將測序結果與Gene Bank中的標準菌株16S rDNA序列進行對比[10]。

2 結果與分析

2.1 耐膽鹽菌株的分離

分離培養基MRS、SL、TPY、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養基、腦心浸液瓊脂培養基(BHI)均為以溴甲酚紫為酸性指示劑(pH 5.2～6.8，黃—紫)并且含膽鹽的選擇性培養基。因為乳酸菌分解代謝糖并且產酸，所以當菌落產酸時，培養基上就有顏色由紫色變為紅色或黃色的菌落。挑取較大直徑的紅色或黃色的單菌落，對其進行革蘭氏染色并鏡檢，篩選出G+。將在石蕊牛奶試驗中能夠凝乳并使藍紫色牛奶變為粉紅色的革蘭氏陽性菌初步確認為乳酸菌[11]。

以下為幾種典型的鏡檢結果，見圖1。由鏡檢圖片可觀察出圖1(b)、(i)及(g)的菌體為細長桿狀。圖1(d)顯示的菌體與前者比較稍短且部分呈“Y”字形。而圖1(a)中菌體為稍粗的桿狀。從圖1(c)、(e)、(f)及(h)中可觀察出菌體為短桿狀甚至接近球狀。

2.2 耐膽鹽菌在pH 5.0條件下的耐酸篩選結果

將分離出來的42株耐膽鹽菌株接種到pH 5.0的MRS液體培養基，分別在0，4，6，8 h取樣，用酶標儀檢測在600 nm下的OD值，其中有10株菌的OD值增加。OD值變化的情況見圖2。結果顯示，10株待選菌株均能在pH 5.0環境下生長，OD值變化范圍集中在6.71%～34.55%，其中EM5的增長率最大，達34.55%。由于菌株4-5、5-2的增長率較低，因此認為此2株菌其酸耐受能力不明顯。最終選擇8株菌進行pH 4.0的耐酸能力篩選。

圖1 革蘭氏染色結果(1 000×)

圖2 pH 5.0環境下菌株生長情況

2.3 8株菌在pH 4.0條件下的耐酸篩選結果

從pH 5.0環境下篩選出的8株菌進行pH 4.0環境下的耐酸篩選。將8株菌接種至pH值已調至4.0的MRS液體培養基上，放入酶標儀測定其600 nm下0，4，6，8 h的OD值。篩選出在上述環境中能夠生長的菌株共8株，OD值見圖3。結果顯示，8株菌在pH 4.0環境下均有生長。OD值變化范圍集中在5.88%～54.58%，因此最終選擇8株菌進行pH 3.5的耐酸能力篩選。同時，將此環境下菌株生長情況與pH 5.0培養基中試驗菌株的生長情況進行比較，總體來說大部分菌株的OD值增長率呈減小趨勢。

2.4 3株菌在pH 3.5條件下的耐酸篩選結果

由圖4可知，在0～8 h在pH 3.5的MRS培養基中，篩選出在pH 3.5酸性環境下均能生長的3株菌，即5-5、EM5、EB 4。其中EM5在0～8 h內所增長的OD值幅度最大，達116.04%，說明它在pH 3.5條件下生長情況良好。以上3株菌對pH 3.5酸性具有一定耐受能力，有必要在pH 3.0的環境中繼續培養，并作平板計數以測定0～3 h的活菌數和存活率，便于進一步作酸耐受性的評價。

圖3 pH 4.0環境下菌株生長情況

圖4 pH 3.5環境下菌株生長情況

2.5 3株乳酸菌的pH3.0 MRS培養液耐受性篩選試驗結果

pH 3.0為耐受試驗計劃的最高酸度，不同菌株對酸的耐受性差異較大。經過pH 5.0，4.0，3.5的耐酸篩選后，篩選出的5-5、EM5、EB4。將供試菌株接入pH 3.0的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養，分別于1，2，3 h取出部分菌液進行活菌計數并計算存活率。

由表1可知，不同菌株在pH 3.0環境中耐受性有較大差異，菌株對酸性環境耐受性隨培養時間的延長而降低。在pH 3.0環境中生長1 h后，菌數下降都很明顯，但是5-5菌株下降了5個數量級，而且在培養2 h后5-5菌株便不再存活，表明在較低酸性的環境不利于5-5的存活。EM5對酸的耐受性最強，在pH 3.0 MRS液體培養基中37 ℃厭氧保溫3 h后存活率達到46%，EB4在2～3 h的存活率幾乎為0，根據之前不同酸度下菌株的生長情況，選擇對酸耐受性最強、最穩定的EM5作為分子生物學16S rDNA鑒定的對象。

表1 pH 3.0條件下存活菌數

2.6 擴增產物測序及分析

回收的擴增產物由上海華大生物工程有限公司測序。采用 BLAST將菌株EM5的16S rRNA序列進行比對，經比對后發現，與EM5 16S rDNA序列同源性最高者為Lactobacillusplantarum，相似性為99%，因此初步鑒定菌株EM5為一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[12]。

3 結論

本研究從嬰兒糞便中分離出42株耐膽鹽的乳酸菌，對其進行了石蕊牛奶試驗鑒定。以菌株的耐酸受性、OD值、存活率、活菌變化數等穩定性指標對菌株進行篩選，共篩選出在pH 3.5環境下能夠生長的3株菌5-5、EM5、EB4。其中對酸和膽鹽的耐受能力最強最穩定的是EM5，它在pH 3.0條件下培養1，2，3 h后的存活率分別為75%，64%，46%。對菌株進行16S rDNA鑒定，結果表明EM5與Lactobacillusplantarum同源性達到了99%[13-14]。

本研究發現EM5菌株對酸和膽鹽的耐受性較高，具有進一步研究的可行性。由于該株乳酸菌是人源性的，具有公認的安全性，可以將其應用于乳制品、功能性益生菌制劑直接應用于人體，也可以制成其它市場所需的產品，為以后的乳酸菌生理功能的開發研究提供了新的菌種資源。

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Screening and identification ofLacticAcidBacteriawith acid and bile tolerance

LU Yuan-ling

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)

In order to screen human probiotics with the acid and bile resistant abilities, infant stool diluents were spread on five different selective ager plates including TPY, BHI, MRS and SL in this study. 42 strains of lactic acid bacteria with certain bile-tolerance were isolated by selective ager media for lactobacilli, supplemented with bile salt (0.2%) and bromcresol purple as an acid indicator. 3 strains of lactic acid bacteria with high acid tolerance were further selected from 42 strainsaccording to biomass of their cultured in the MRS liquid medium with pH 5.0, pH 4.0 and pH 3.5 respectively. Then the viability of these 3 strains in MRS medium with pH 3.0 was measured by plate colony count technique, resulting in one of them with the highest acid- and bile salt-tolerance. Then this strain was subsequently identified using 16S rRNA-based molecular biological approaches. The strain was molecularly identified to be.Lactobacillusplantarum. The strain could be used as a potential probiotic strain for late digging its probiotic function.

lactic acid bacteria; bile-tolerance; acid-tolerance; screening; identification

國家科技部863計劃(編號：2007AA10Z353)；江蘇高校哲學社會科學重點基金項目(編號：2017ZDIXM035)

呂源玲 (1974—)，女，江南大學工程師，碩士。 E-mail:383274108@qq.com

2017—03—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.009