玉米降血糖活性肽制備分離及其氨基酸序列分析

胡宇航 戴 軍 陳尚衛 朱 松 張學軍 張 平

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3. 山東天久生物技術有限公司，山東 菏澤 274108)

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玉米降血糖活性肽制備分離及其氨基酸序列分析

胡宇航1,2戴 軍1陳尚衛1朱 松1張學軍3張 平3

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3. 山東天久生物技術有限公司，山東 菏澤 274108)

以水解度(DH)和游離氨基酸含量為指標優化玉米蛋白粉的酶水解工藝，結果顯示，在pH 8.5，60 ℃條件下經過正交試驗得到最適組合為：酶底物比3.5 g/100 g，水解時間2 h，料液比1∶20 (g/mL)，在該條件下其DH為27.02%，多肽含量為85.23%。同時，還優化了玉米肽的脫色工藝，最佳條件為：溫度50 ℃，pH 3.5，活性炭用量1.5 g/100 mL，脫色時間45 min，該條件下玉米肽得率為77.86%，脫色率為87.27%。將脫色脫鹽后的玉米多肽經過凝膠色譜分離得到3個組分。體外降血糖活性結果顯示，CP1促進正常HepG2細胞葡萄糖消耗效果最優，并且其α-糖苷酶抑制活性也最高(34.64%)；CP1經過RP—HPLC制備柱純化得到含量較高的14個組分，其中CP1-13的α-糖苷酶抑制活性最強，達到39.50%。經UPLC—Q—TOF—MS/MS測定，其氨基酸序列為A-P-A-L-L-P-F。

玉米肽；水解；降血糖活性；氨基酸序列

近年來，臨儲價格不斷增加使2012年后玉米產量和臨儲量不斷增高，同時使中國進口玉米和替代品也大幅增加。據報道[1]，2016年中國玉米儲量超過2.5×108t，遠超2016年玉米產量2.18×108t。雖然目前調整玉米臨時收儲政策為“市場化收購”加“補貼”的新機制，有效地減少了進口玉米和替代品的量，但要消化掉這些臨儲玉米難度頗大。玉米蛋白粉水溶性和風味差，是限制性蛋白，多用于飼料工業。酶解玉米蛋白粉，會提高其在食品工業中的應用價值[2]。

玉米蛋白中含有許多支鏈氨基酸，疏水氨基酸，水解后會得到大量的含有這些氨基酸的小肽。國內外研究者關于玉米肽的活性也作了大量研究，結果表明[3]玉米肽對恢復運動疲勞，醒酒護肝，清除自由基抗氧化，降血壓都有很好的作用。目前，國內外市場上有許多的玉米肽保健產品，主要分為兩大類：① 功能性飲料，包括醒酒護肝類飲品和運動飲品；② 經過水解后的玉米粗肽產品，目前中國已經有幾家生物肽公司規模生產玉米粗肽產品。

隨著人口老齡化和物質生活水平的提高，糖尿病的發病率呈現迅速增長的趨勢。目前國內外對具有降血糖作用的生物活性肽進行了大量研究。Luis Mojica等[4]研究顯示黑豆肽可以有效減少Caco-2細胞模型的葡萄糖吸收，使口服葡萄糖耐量試驗的小鼠餐后葡萄糖水平降低24.5%。Rim Nasri等[5]通過研究發現蝦虎魚蛋白酶解物可以顯著減少喂食高脂高糖飼料小鼠的α-淀粉酶活性和血糖含量。黃景麟等[6]研究發現抗菌肽Dybowskin-2CDYa可以促進胰島細胞增殖和胰島素分泌，在高血糖條件下會有效降低血糖水平且不會引起低血糖。關于玉米肽降血糖的研究較少。根據李翔[7]的研究顯示，在飲食中添加玉米肽不僅可以降低肥胖大鼠的胰高血糖素(glucagon)水平，還能降低大鼠體內MCP-1(單核細胞趨化蛋白-1)的水平，提高PYY(酪酪肽)的水平，后兩者被認為與高血糖癥密切相關。Taisuke Mochida等[8]研究發現玉米蛋白水解物對小鼠可以起到誘導GLP-1的分泌和抑制GPL-1降解的雙重作用，從而增加胰島素的分泌。Noriyuki Higuchi等[9]在此基礎上對正常的雄性大鼠和患有糖尿病的GK大鼠喂食玉米蛋白水解物，結果顯示口服也能夠促使GLP-1和GIP含量的增多；在糖耐量試驗中，口服玉米醇溶蛋白水解液可以顯著抑制升糖反應，說明其提高了正常和糖尿病大鼠的糖耐量。上述研究表明玉米蛋白肽具有明顯的降血糖作用，但中國相關報道很少。本試驗首先對玉米蛋白水解工藝進行了優化，然后進一步分離純化，并進行降血糖活性研究，以篩選出活性組分并測序。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉(CGM)：蛋白含量68.27%，中食都慶(山東)生物技術有限公司；

中溫α-淀粉酶：4 000 U/g，無錫市酶制劑廠；

堿性蛋白酶(Alcalase)：2.4 L(2.4 AU/g)，丹麥諾維信公司；

767活性炭、聚丙烯酰胺凝膠、P-2 Gel：美國伯樂醫藥生命醫學產品公司；

HepG2：美國Ctccbio Science公司；

FBS、DMEM：生化試劑，美國Hyclone 公司；

DMSO：分析純，中國賽默飛世爾科技；

α-糖苷酶：100 UN，西格瑪奧德里奇(中國)公司；

乙腈、TFA：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

NaOH、HCl、NaCO3、酒石酸鈉、酚試劑等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波生物科技有限公司；

高速冷凍離心機：Beckman J-26xp型，美國貝克曼公司；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

定時數顯恒流泵：HL-2D型，上海滬西分析儀器廠；

紫外檢測器：HD-3型，上海滬西分析儀器廠；

細胞培養箱：Thermo Scientific 8000型，美國賽默飛世爾科技公司；

倒置光學顯微鏡：XDS-1A型，上海蔡康光學儀器有限公司；

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC型，美國Waters公司；

高效液相色譜儀：Waters 2545型，美國Waters公司；

超高液相色譜—飛行時間質譜聯用儀：Waters Acquity UPLC-Waters MALDI Synapt Q-TOF型，美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米低聚肽的制備工藝

玉米蛋白粉→α-淀粉酶水解→堿性蛋白酶水解→活性炭脫色→過濾(0.22 μm)→納濾脫鹽→冷凍干燥→玉米低聚肽

1.2.2 玉米蛋白粉組成分析及預處理

(1) 水分含量的測定：按GB 5009.3—2010執行。

(2) 灰分含量的測定：按GB 5009.4—2010執行。

(3) 蛋白含量的測定：按GB 5009.5—2010執行。

(4) 脂肪含量的測定：按GB/T 14772—2008執行。

(5) 預處理：取100 g玉米蛋白粉原料，過80目篩，加入1 000 mL水，90 ℃糊化1 h，冷卻至65 ℃，調pH至5.5，加入0.5 g/100 g·原料預先在65 ℃下活化的中溫淀粉酶，反應2 h，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，再水洗2次，沉淀物冷凍干燥。

1.2.3 酶解工藝優化 經過預處理的CGM加入一定量的水，預先在80 ℃下水浴20 min，攪拌，然后在適宜條件下水解，結束后90 ℃加熱20 min滅酶，離心取上清液。玉米蛋白粉的酶解工藝優化先進行單因素試驗，影響因素分別為：pH、溫度、料液比、酶底物比[E]/[S]、酶解時間，響應值為水解度(DH)[10]。單因素試驗選出最優pH為8.5，最適溫度為60 ℃。然后以酶底物比、酶解時間、料液比為因素進行3水平的正交試驗，見表1。以水解度[10]和游離氨基酸[11] 16為指標并參考行業標準(QB/T 4707—2014)選出最優工藝條件，多肽含量由總蛋白質含量減去游離氨基酸含量得出。

表1 酶解工藝正交試驗因素水平設計

1.2.4 脫色條件優化 因蛋白水解液中色素的存在導致水解后顏色加深，同時存在一定程度的褐變，影響其品質，所以應進行脫色。參考文獻[12]的脫色方法，以得率和脫色率為指標進行脫色優化，采用加權評分法：Z=0.5X+0.5Y，其中X為脫色率(%)，Y為肽損失率(%)。經過前期單因素試驗確定反應溫度為50 ℃，進行正交試驗，因素水平設計見表2，正交試驗篩選最優工藝。

1.2.5 納濾脫鹽 趁熱將脫色得到的混合液過濾得到澄清的玉米蛋白水解液，調節pH至6.5。將澄清玉米蛋白水解液使用180 D的納濾膜納濾脫鹽并將其濃縮凍干。

表2 脫色工藝正交因素水平設計

1.2.6 聚丙烯酰胺柱分離多肽 將凍干脫色的玉米多肽上聚丙烯酰胺柱(Bio-Gel P-2 Gel，4.5 cm×90 cm)進行分離，在進樣前用超純水進行平衡。取1 g多肽樣品溶于30 mL去離子水中，水膜過濾，然后過聚丙烯酰胺柱分離，流速為2.5 mL/min，220 nm紫外檢測，按照不同的出峰時間收集，得到3個不同的組分。將3個組分進行濃縮凍干進行下一步篩選及分離純化。

1.2.7 降血糖活性研究

(1)α-葡萄糖甘酶抑制活性：測定不同組分的α-葡萄糖甘酶抑制活性，參考文獻[13]的方法，作如下改動，預先加入300 μL磷酸緩沖液，再加入0.2 U的α-葡萄糖甘酶50 μL和2 mg/mL樣品100 μL，振蕩混勻后，將其在37 ℃恒溫10 min，快速加入5 mmol PNPG 100 μL混勻，37 ℃恒溫20 min后，加入0.5 mol NaCO3800 μL混勻，在405 nm下測定吸光值A1，設置空白對照，另不加樣品的對照組吸光值A2，不加酶的背景組A0。抑制率按式(1)計算：

(1)

式中：

I——α-糖苷酶抑制率，%；

A0——對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值；

A2——背景組吸光值。

(2) 多肽對正常細胞葡萄糖消耗的影響：先進行細胞培養得到對數生長期的HepG2，傾去培養液，用PBS清洗1次，然后加適量胰蛋白酶—EDTA消化液，37 ℃消化1～3 min變為球形后，加入10%胎牛血清DMEM培養液終止消化反應。1 000 r/min離心5 min，去上清后，調整細胞密度約4×105cells/mL，100 μL/孔接種于96孔板，然后在37 ℃，5% CO2，95%濕度培養24 h。在細胞貼壁后，按組進行葡萄糖消耗試驗。樣品預先用DMEM培養基配好試驗分為玉米肽高中低劑量組，正常HepG2對照組和二甲雙胍組(0.01 mg/mL)組，每組3個復孔，培養24 h后，每孔取細胞上清液用葡萄糖試劑盒測定各組的葡萄糖含量[14]。

MTT試驗，將上述孔板每孔加入10 μL MTT，置于培養箱中避光培養3～4 h，加入200 μL的DMSO，室溫震搖10 min；在492 nm處測量同一時間的OD 值，進行細胞增殖影響分析[14]。

1.2.8 反相高效液相色譜分離純化(RP-HPLC) 將冷凍干燥活性最高的組分用制備型反相高效液相色譜(RP—HPLC)分離純化[15]。儀器為Waters2545制備型高效液相色譜儀，色譜柱為Waters xBriidge PrepC18(250 mm×19 mm，5 μm)。紫外檢測波長220 nm，柱溫20 ℃，多肽樣品濃度50 mg/mL，進樣量500 μL，流速10 mL/min。流動相：A為純乙腈，B為0.05% TFA，其二元梯度洗脫條件為：0～40 min，95% A～65% A；40～45 min，65% A～20% A；45～50 min，20% A～20% A；50～55 min，20% A～95% A；55～60 min，95% A～95% A。重復收集其組分進行濃縮冷凍干燥。

1.2.9 降血糖肽氨基酸序列的確定 用RP—HPLC分離純化的組分測定其α-糖苷酶抑制活性，篩選出活性較高組分，由超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(UPLC—Q—TOF—MS/MS)測定其氨基酸序列。

(1) 液相色譜條件：色譜儀為WATERS ACQUITY UPLC型；檢測器為WATERS ACQUITY PDA型；檢測波長200～400 nm；色譜柱：BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；柱溫：45 ℃，流速：0.3 mL/min；樣品：濃度1 mg/mL，進樣量5 μL；流動相：A 0.1%甲酸，B乙腈；其二元洗脫曲線為，0～40 min，100% A～70% A；40～45 min，70%～20% A；45～50 min，20%～0% A；50～55 min，0%～100% A。

(2) 質譜條件：儀器為WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS型；離子方式為ESI+；毛細管電壓3.5 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣：溫度400 ℃，氣流700 L/ h，錐孔氣流 50 L/h；碰撞能量6/20 V；質量范圍20～2 000m/z；檢測器電壓1 800 V。

2 結果與討論

2.1 玉米蛋白粉組成及預處理結果

由表3可知，中溫α-淀粉酶處理后玉米蛋白粉的蛋白含量達到81.25%(以干基計)，為淺黃色固體粉末。預處理有效地提高了蛋白含量，便于水解的進行。

表3 CGM與預處理后樣品組成成分

2.2 酶解工藝優化

由表4可知，影響DH的因素順序為：酶底物比>料液比>酶解時間，最優的組合為A3B3C2。在保證水解度高的前提下，游離氨基酸含量越低，多肽含量就越高，活性肽就越多。影響游離氨基酸含量的因素順序為：酶底物比>料液比>酶解時間，最優組合為A1B1C2。綜合考慮玉米肽的得率和游離氨基酸含量，選取A3B1C2為最優水解條件，其DH為27.02%，游離氨基酸含量為1.87%。水解液為深黃褐色液體。

2.3 蛋白水解液的脫色及脫鹽

由表5可知，影響肽得率和脫色率的因素順序為：活性炭用量>pH>時間。綜合考慮Z值、得率與脫色率，選擇第二組為最佳脫色工藝。最終選定脫色條件為：溫度50 ℃，pH 3.5，活性炭用量：1.5 g/100 mL的活性炭，脫色時間45 min，此條件下玉米肽得率為77.86%，脫色率為87.27%。經過脫鹽，玉米肽蛋白含量(以干基計)為90.91%；多肽含量(以干基計)為88.85%，遠高于行業標準中的80%和75%，是一種優質的玉米肽產品。經過水解及脫色脫鹽，其最終產品得率為37.10%。

表4 酶解工藝正交試驗結果及分析

表5 脫色工藝正交結果及分析

2.4 凝膠過濾色譜分離

用聚丙烯酰胺凝膠柱對脫色脫鹽后的玉米多肽進行分離，其洗脫曲線見圖1。按照出峰順序分成如下3個組分，分別命名為CP1，CP2，CP3。將3組樣品進行體外降血糖活性分析，以進一步篩選和分離。

圖1 聚丙烯酰胺凝膠柱分離色譜圖

2.5 體外降血糖活性

如表6所示，各組在經過MTT試驗矯正后的GC/OD與對照組相比較，顯示各組分對葡萄糖的消耗均有一定的促進作用，其中粗肽、CP1量效關系較為明顯。但是各組的值均未達到二甲雙胍組的，且有部分值低于對照組，考慮到MTT試驗結果，可能為玉米肽具有促進HepG2細胞(人體肝癌細胞)凋亡的作用，在一定程度上影響了其生物活性，與LI Jiang-tao等[16]的研究結果一致。α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗顯示，在3個組分中CP1的活性最高為34.59%。表明玉米肽具有較好的降血糖活性。

2.6 制備型反相高效液相色譜分離

將經過凝膠色譜柱(Bio-Gel P-2 Gel)分離的活性較好的組分CP1用制備型RP—HPLC進行分離制備，分離的色譜圖見圖2。收集的組分中含量較高的組分共14個，其α-糖苷酶抑制活性見圖3，其中CP1-13的活性最高達到了39.5%，對其進行氨基酸序列分析。

2.7 氨基酸序列分析

CP1-13經過UPLC—Q—TOF—MS/MS分析，二級質譜圖見圖4，用Biolynx軟件處理后得到該肽組分氨基酸序列為A-P-A-L-L-P-F。二肽基肽酶(DPP-Ⅳ)能夠通過特異地斷開X-Ala和X-Pro的N末端來調節氨基酸激素循環的生物活動，如胰高血糖素肽類(GLP-1)的代謝[17]。Tadashi Hatanaka等[16]在文獻中提到具有抑制DPP-Ⅳ活性的小肽，其氨基酸序列中倒數第二位均為Pro，包括抑二肽素類(Ile-Pro-Ile，Val-Pro-Leu)和膠原蛋白肽類(Gly-Pro-X)。從氨基酸序列來看，七肽與膠原蛋白肽類(Gly-Pro-X)結構相似，DPP-IV不能特異地斷開X-Pro-Phe中的Pro，推測其可能為DPP-IV抑制劑，需進一步研究來證實。Zhuang Hong等[18]在玉米抗氧化肽的研究中曾經發現過一個四肽L-L-P-F，其具有很好的抗氧化活性；黃文浩等[19]在研究降血壓活性中發現的3個肽中有一種序列為Q-Q-L-L-P-F；Ma Zhi-li等[20]色譜分離得到醒酒肽單體，序列為R-L-L-P-F。這3種肽與本試驗所發現的七肽中后4個氨基酸序列相同，說明X-L-L-P-F為玉米肽活性組成中的一個特征序列。

表6 玉米蛋白肽的體外降血糖活性?

?GC為葡萄糖消耗量，OD為MTT試驗中的OD值，GC/OD為校正值；*為差異顯著，P<0.05；**為差異極顯著，P<0.01。

圖2 制備型反相超高液相色譜分離CP1色譜圖

圖3 反相超高液相色譜儀分離CP1組分的α-糖苷酶抑制活性

圖4 二級質譜得到CP1-13的氨基酸序列圖

3 結論

(1) 經過條件優化，確定了脫色效果好、肽含量較高的最佳水解和脫色工藝，其條件分別為：pH 8.5，溫度60 ℃，酶底物比3.5 g/100 g，水解時間2 h，料液比1∶20 (g/mL)；脫色溫度50 ℃，pH 3.5，活性炭用量1.5 g/100 mL，脫色時間45 min。以體外降血糖活性為篩選指標，得到體外降血糖活性較強的CP1-13號肽組分，經過二級質譜分析其氨基酸序列為A-P-A-L-L-P-F，分子量為727.89。目前國內外關于降血糖玉米肽的研究較少，馬偉[11] 40-41曾以α-糖苷酶活性分離出一個八肽為A-E-P-N-L-S-G-D-A-P，尚無其它具有降血糖活性的玉米肽單體報導。本研究為進一步開發、優化玉米蛋白資源和研究玉米肽的降糖活性提供了新的依據。

(2) 本研究只進行了體外降血糖活性的研究，有待動物試驗的進一步驗證；另本研究得到了的氨基酸序列還需要進一步化學合成，并與分離到的CP1-13的質譜進行分析比對，并驗證其生物活性。

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Preparation, separation and amino acid sequence analysis of corn peptides with hypoglycemic activity

HU Yu-hang1，2DAI Jun1CHEN Shang-wei1ZHU Song1ZHANG Xue-jun3ZHANG Ping3

(1. The School of Food Science and Technology of Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China;2. State Key Laboratory of Food Science and Technology of Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China;3. Shangdong Tianjiu Biotechnology Co, Ltd., Heze, Shandong 274108, China)

In this study, the degree of hydrolysis (DH) and polypeptide content were index optimization for corn gluten meal of hydrolysis process. Under the condition of pH 8.5, 60 ℃, orthogonal experiment to obtain the optimal combination for: amount of enzymeenzyme 3.5 g/100 g, hydrolysis time 2 h, solid-liquid ratio 1︰20 (g/mL); on this condition, theDHis 27.02%, peptide content is 85.23%. Meanwhile, optimized the decolorization technology, the best conditions: temperature 50 ℃, pH 3.5, activated carbon dosage: 1.5 g/100 mL, decoloring time 45 min; under the condition, corn peptide yield was 77.86%, the decolorization rate was 87.27%. After decoloring and desalination, three components were isolated by chromatographic separation. The result of hypoglycemic activity in vitro showed that CP1 had the better effect on promoting normal HepG2 cells’ glucose consumption, and theα-glycosidic enzyme inhibitory activity reached 34.64%, after RP-HPLC column purification, 14 components were gotten; the thirteenth (CP1-13) had the bestα-glycosidic enzyme inhibitory activity, and reached 39.50%. Determined by UPLC-Q-TOF-MS/MS, the amino acid sequence was A-P-A-L-L-P-F.

Corn peptide; hydrolysis; hypoglycemic activity; amino acid sequence

胡宇航，男，江南大學在讀碩士研究生。

戴軍(1957—)，男，江南大學研究員，博士。 E-mail:daihplc@163.com

2017—04—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.030