兒茶素EGCG對Caco—2細胞α—葡萄糖苷酶活性的抑制作用研究

劉淑媛++艾仄宜++陳玉瓊++倪德江

摘要：試驗對Caco-2細胞膜上蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶活性進行不同培養時間檢測，并以兒茶素單體EGCG作為抑制劑，探究其對Caco-2來源的蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制效果。結果表明，Caco-2細胞培養18 d后膜表面具有較高活性的蔗糖酶和麥芽糖酶，可用于進行α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選。兒茶素EGCG具有蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性，抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。

關鍵詞：茶；EGCG；蔗糖酶；麥芽糖酶；Caco-2細胞

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2479-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.020

Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of EGCG in Caco-2 Cells

LIU Shu-yuan， AI Ze-yi， CHEN Yu-qiong， NI De-jiang

（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology， Ministry of Education/College of Horticulture and Forestry Sciences，

Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： This research used the Caco-2 cell monolayer model in vitro to simulate the α-glucosidase activity at different culture days. EGCG was used as an inhibitor to investigate the inhibition activities on sucrase and maltase in Caco-2 cells. The results illustrated that Caco-2 could be used to estimate α-glucosidase inhibitory activity after 18 days with high sucrase and maltase activities. EGCG showed inhibitory effect on sucrase and maltase in Caco-2 cells， with the IC50 values of 31.08 μg/mL and 36.44 μg/mL， respectively.

Key words： tea； EGCG； sucrase； maltase； Caco-2

茶作為世界上三大飲品之一，其抗癌、抗氧化、降血糖、降血脂等健康功效已得到廣泛證實[1-4]。兒茶素被認為是茶發揮其健康功效的主要成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中兒茶素的重要單體，占兒茶素總量的約80%。已有大量文獻以兒茶素EGCG為研究對象，研究其在細胞上抑制腫瘤細胞生長、保護細胞膜損傷、信號通道等作用機理[5-7]。

α-葡萄糖苷酶在碳水化合物消化吸收方面發揮重要作用，是Ⅱ型糖尿病治療的靶點之一。本茶生理生化課題組實驗室前期體外實驗研究發現EGCG是茶葉中對α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要成分，其抑制IC50僅為0.059 mmol/L，遠小于陽性對照阿卡波糖（阿卡波糖IC50為7.19 mmol/L）[8]。Matsumoto等[9]利用大鼠體內試驗研究發現兒茶素短時間（提前30 min）灌胃Wistar大鼠，可降低大鼠小腸上皮黏膜蔗糖酶活性。人結腸腺癌細胞系Caco-2模型具有與人小腸上皮細胞相似的糖消化、吸收和葡萄糖異生相關的酶，可應用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選[10，11]。為此，試驗采用Caco-2模型，分析兒茶素EGCG對蔗糖酶和麥芽糖酶這兩種α-葡萄糖苷酶的抑制效果，以期為兒茶素抑制餐后血糖升高，減緩糖尿病癥狀提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Caco-2細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所；EGCG購自Sigma公司（E4143，純度 >95%）；DMEM培養液、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素及胰蛋白酶（含0.02% EDTA）均購自美國Hyclone公司；支原體抗生素Plasmocin購自Invivogen公司；cck-8試劑盒和葡萄糖測定試劑盒購自南京建成生物科技發展有限公司；細胞培養瓶以及24孔細胞培養板購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養

將處于對數生長期的細胞接種于24孔板，接種密度為4 000個/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養箱中培養。使用DMEM培養液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素/鏈霉素，1%的L-谷氨酰胺，0.25 mg支原體抗生素plasmocin）培養細胞，隔天換液。

1.3 兒茶素EGCG對Caco-2細胞增殖的影響

采用cck-8法評價200 μmol/L濃度范圍內EGCG對Caco-2細胞增殖的影響。細胞接種于96孔板，接種密度為104個/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培養箱中培養48 h。棄去舊培養基，分別加入含10、30、50、100、200 μmol/L EGCG的培養液，繼續培養24 h。加入10 μL cck-8試劑，37 ℃孵育1 h后450 nm處測OD值。用細胞存活率來衡量EGCG在Caco-2細胞模型上的安全負載量。

1.4 Caco-2細胞中α-葡萄糖苷酶活性檢測

Caco-2細胞接種后分別于14、16、18、20、22和24 d檢測細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶活性。蔗糖、麥芽糖溶液均為28 mmol/L，用磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.4）溶解，過0.22 μmol/L膜抽濾滅菌，37 ℃預熱待用。Caco-2細胞棄去舊的培養液，用37 ℃預熱的PBS緩沖溶液清洗細胞表面3次。每孔加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液，37 ℃孵育40 min，冰浴結束反應。根據葡萄糖測定試劑盒方法檢測產物葡萄糖含量。

1.5 兒茶素EGCG對Caco-2細胞上α-葡萄糖苷酶活力的影響

Caco-2細胞培養至21 d，棄去舊的培養液，用37 ℃預熱的PBS緩沖溶液清洗細胞表面3次，加入1 mL含不同濃度EGCG的蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L，PBS溶解），37 ℃孵育40 min。冰浴結束反應。陰性測定組加入1 mL蔗糖/麥芽糖溶液（28 mmol/L），空白組加入1 mL PBS緩沖溶液。根據葡萄糖測定試劑盒方法檢測產物葡萄糖含量。根據下面公式計算抑制率：

抑制率=[（OD陰性對照組-OD樣品測定組）/（OD陰性對照組-OD空白）]×100%

1.6 數據分析

采用Excel軟件進行數據分析，試驗數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 兒茶素EGCG毒理

不同濃度兒茶素EGCG孵育Caco-2細胞24 h細胞活力見圖1。從圖1可以看出，兒茶素EGCG在濃度達200 μmol/L濃度時，細胞存活率仍大于80%。在此濃度范圍內對Caco-細胞增殖無明顯影響，可用于后續試驗。

2.2 不同培養時間Caco-2上蔗糖酶和麥芽糖酶變化

Caco-2細胞接種24孔板，約7 d后細胞融合，開始分化。從圖2和圖3可以看出，細胞膜表面酶活性隨細胞培養時間的延長而增強。蔗糖酶活性在細胞培養14～18 d之間活性變化平穩，且酶活性較低。18 d后蔗糖酶活性逐漸增強，至培養24 d時，蔗糖酶活性仍保持上升趨勢。麥芽糖酶活性自細胞培養16 d時逐漸增強，培養24 d后仍保持上升趨勢。蔗糖酶和麥芽糖酶活性在20～22 d之間均變化平穩，故細胞培養21 d用于兒茶素EGCG對此兩種酶活性的抑制試驗。

2.3 兒茶素EGCG對Caco-2細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用

從圖4可以看出，兒茶素EGCG對Caco-2細胞上蔗糖酶和麥芽糖酶均有抑制效果，且抑制作用隨濃度的增大而增強。當EGCG濃度超過一定范圍后對蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性的增強都減弱。EGCG對蔗糖酶和麥芽糖酶抑制IC50分別為31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。EGCG對蔗糖酶的抑制效果要略強于麥芽糖酶。然而，在低濃度（10 μmol/L）情況下，兒茶素EGCG對麥芽糖酶抑制率高于蔗糖酶。

3 小結與討論

α-葡萄糖苷酶是一類能夠催化水解葡萄糖基的酶的總稱。α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸內α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。中國人飲食結構主要是淀粉，麥芽糖酶和蔗糖酶在食物消化成可被吸收的單糖過程中發揮主要作用。Caco-2細胞來源于人結腸腺癌細胞，體外培養時能自發地進行類似腸道細胞的形態學和生化學上的分化，獲得許多小腸吸收細胞的特性。Caco-2細胞不同培養天數后蔗糖酶和麥芽糖酶活性檢測結果表明，培養18 d后具有該細胞較高的蔗糖酶和麥芽糖酶活性，可用于研究藥物對Caco-2細胞來源的蔗糖酶和麥芽糖酶活性的研究。Caco-2細胞孵育麥芽糖較孵育蔗糖時酶解產物葡萄糖含量高，說明Caco-2細胞上麥芽糖酶活性高于蔗糖酶。兒茶素EGCG對Caco-2來源的兩種α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且抑制作用有劑量依賴性。Xu等[12]對多種兒茶素單體體外α-葡萄糖苷酶活性比較得出，EGCG具有最強α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制類型為混合型抑制。Kamiyama等[13]對兒茶素小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制研究發現，EGCG對麥芽糖酶的抑制活性遠強于抑制蔗糖酶的活性，其抑制IC50分別為16 μmol/L和 130 μmol/L。在本試驗中EGCG抑制蔗糖酶活性略強于抑制麥芽糖酶活性。不同的結論與試驗所用的α-葡萄糖苷酶來源有極大相關性。EGCG在濃度為10 μmol/L時對麥芽糖酶的抑制率即接近于40%。EGCG與蔗糖酶和麥芽糖酶的結合特性還有待進一步研究。

兒茶素因其生物利用度低，在實際應用中受到極大限制。小鼠口服兒茶素[3H]-EGCG 1 h后，胃部存留率為30.7%，小腸部位存留率40.6%，之后大部分兒茶素隨糞便、尿液排出體外，血液中[3H]-EGCG含量在24 h時約2%[14]。人體空腹口服EGCG含量高達800 mg/mL時，約2 h血液中EGCG含量達到峰值，最高濃度僅為1.6 mg/mL[15]。可見口服兒茶素后，在體內主要作用部位為小腸細胞。藥物在小腸部位降血糖機理涉及鈉葡萄糖共轉運載體（SGLT1）、葡萄糖協助擴散轉運載體（GLUT2）、為SGLT1提供動力的Na+-K+-ATP酶及水解產生葡萄糖的α-葡萄糖苷酶。兒茶素抑制糖轉運體和Na+-K+-ATP酶功效亦有相關報道[16-18]。然而，兒茶素在小腸的部位不同，降低糖吸收途徑的抑制效果的貢獻率，及多種途徑間是否有協同作用仍有待研究。

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