以臍帶間充質干細胞為載體的靶向基因治療系統聯合5-FU對裸鼠HepG2移植瘤的作用

孔凡妮，查劍英，楊圓圓，盧楊 ，李真真，張硯君(中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所，天津30000；西安交通大學第二附屬醫院)

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以臍帶間充質干細胞為載體的靶向基因治療系統聯合5-FU對裸鼠HepG2移植瘤的作用

孔凡妮1，查劍英1，楊圓圓1，盧楊1，李真真2，張硯君1
(1中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所，天津300020；2西安交通大學第二附屬醫院)

目的 構建以人臍帶間充質干細胞(HUMSCs)為載體的靶向基因治療系統，觀察該系統聯合低劑量5-FU對裸鼠HepG2移植瘤的治療作用。方法 采用組織塊接種法從新鮮無菌新生兒臍帶中分離HUMSCs，利用PCR、重疊PCR、酶切、連接等分子生物學技術構建慢病毒表達質粒LentiR.E1A和腺病毒穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24，并包裝慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。采用Transwell實驗觀察慢病毒和腺病毒共感染對HUMSCs向HepG2細胞趨化的影響。采用皮下接種的方法建立HepG2移植瘤模型，將荷瘤小鼠分成5組各5只，分別給予尾靜脈注射PBS、HUMSCs、低劑量5-FU、慢病毒感染HUMSCs聯用低劑量5-FU、雙病毒共感染HUMSCs聯用低劑量5-FU的治療，比較各組的抑瘤效應。利用BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒檢測腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯用誘導肝癌細胞凋亡情況。 結果 成功構建了慢病毒表達載體pLentiR.E1A和腺病毒表達載體pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出了慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。Transwell實驗顯示，慢病毒和腺病毒共感染HUMSCs向腫瘤細胞的遷移能力無明顯改變。聯合低劑量5-FU治療裸鼠肝移植瘤中治療組腫瘤體積較對照組減小(P<0.01)。Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯用誘導腫瘤微環境內的腫瘤細胞發生凋亡，其熒光強度明顯強于Ad-Track+5-Fu組和5-Fu組。結論 成功構建了以HUMSCs為載體的靶向基因治療系統，由HUMSCS.LentiR.E1A運載攜帶抑瘤基因的腺病毒Ad-hTERTp-IL24聯用低劑量5-FU對裸鼠HepG2移植瘤有明顯抑制作用。

臍帶間充質干細胞；腺病毒；靶向基因治療系統；5-氟尿嘧啶；HepG2移植瘤

肝癌由于其發病隱匿，患者被確診時往往已達晚期并伴隨肝功能不全，多數預后很差。目前，針對肝癌的傳統治療手段包括手術、化療和放療等，但療效均欠佳。隨著腫瘤分子生物學和現代細胞分子生物學技術的快速發展，基因治療成為未來腫瘤治療的新希望。間充質干細胞具有來源廣泛、擴增迅速、外源基因導入高效、低免疫原性和在體內向炎癥損傷及腫瘤部位歸巢等優勢[1]，作為基因治療的運載細胞受到越來越多的關注。研究[2，3]顯示，將運載體人臍帶間充質干細胞(HUMSCs)攜帶腺病毒復制所必需的早期基因E1A，使其成為腺病毒包裝細胞，具備在腫瘤部位靶向釋放腺病毒的能力。人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTERTp)在腫瘤細胞中具有較高的轉錄活性，能夠驅動抑瘤基因白細胞介素24(IL-24)表達[4，5]。因此，將hTERTp裝載于腺病毒上用以操控IL-24表達，可使該治療基因特異高效地在腫瘤細胞表達而對正常細胞沒有影響[6，7]。復制缺陷型腺病毒有一定的局限性，比如它缺乏條件復制型病毒的放大效應及病毒擴散的能力、治療基因在腫瘤細胞表達水平不高等，勢必影響療效。我們的前期研究已利用基因工程方法成功構建慢病毒表達質粒P LentiR.E1A和腺病毒穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出相應的慢病毒和腺病毒；并證實由雙病毒共感染的HUMSCs可以包裝出IL-24腺病毒，其對HepG2細胞系的感染效率較好[8]。5-FU作為肝癌治療中常用的化療藥物，低劑量的5-FU能提高腫瘤細胞表面柯薩奇腺病毒受體(CAR)表達，與腺病毒聯合應用表現出協同作用[9]，使其抑瘤作用更顯著。在此研究基礎上，近一年時間我們利用經過E1A基因修飾的HUMSCs復制和包裝出由hTERTp啟動子驅動的特異抑瘤基因IL-24的Ad-hTERTp-IL24質粒，觀察其與低劑量5-FU聯合治療HepG2肝癌皮下移植瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 5～6周齡SPF級雌性BALB/c裸鼠，體質量15～17 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。新鮮無菌新生兒臍帶，由天津市中心婦產科提供，獲得孕產婦知情同意。BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒。人肝細胞癌細胞系HepG2、人胚腎細胞系293A由中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所實驗室保存；人胚腎細胞系293T細胞由中國醫學科學院血液學研究所國家重點實驗室程濤教授饋贈。

1.2 HUMSCs的分離培養與鑒定 采用組織塊接種法。將新生兒臍帶剪碎，種植于10 cm2平皿中，于37 ℃、5% CO2孵箱中倒置;貼壁4 h后，添加含10% FBS和2 mmol/L谷氨酰胺的DF-12培養液8 mL。繼續培養7～10 d后，顯微鏡下可見組織塊周圍有長梭形纖維狀細胞爬出，形成克隆樣。待細胞長至70%～80%融合時可進行傳代培養。取培養3～6代HUMSCs，消化離心后分別加入CD105-APC、CD73-PE、CD90-PE、CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE的直標抗體或同型對照抗體，用流式細胞儀進行表型鑒定。3個陽性表面標志CD105、CD73、CD90陽性率均接近100%，3個陰性表面標志CD34、CD45、CD19表達均為陰性，表明獲得了生長狀態良好的HUMSCs。

1.3 慢病毒表達質粒pLentiR.E1A和腺病毒穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24的構建 參考文獻[8]方法，構建表達E1A的慢病毒表達質粒pLentiR.E1A。根據Invitrogen三質粒包裝系統操作手冊，將pLentiR.E1A、pLentiR(空載體對照)分別和2種包裝質粒共轉染293T細胞，收集病毒上清液保存備用。將hTERTp片段和IL24基因全長克隆入pAd-Track，構建腺病毒穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24。將穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24、pAd-Track(空載體對照)分別與pAd-Easy-1骨架質粒正確重組后，根據pAd-Easy腺病毒包裝手冊說明，于293A細胞中包裝腺病毒質粒Ad-hTERTp-IL24。

1.4 雙病毒共感染HUMSCs向HepG2細胞的趨化作用觀察 采用Transwell實驗。取對數生長期HepG2細胞，用含5% FBS的DMEM培養基調整細胞密度為1×105/mL，接種于24孔板中。次日將Transwell小室放入已接種HepG2細胞的24孔板中，于細胞培養箱預平衡1 h。其間消化收集腺病毒和慢病毒共感染12 h的HUMSCs(雙病毒共感染HUMSCs組)，共感染腺病毒和對照慢病毒LentiR的HUMSCs(慢病毒感染HUMSCs組)和未處理的空白HUMSCs(對照組)。培養20 h后，取出小室用0.1%結晶紫溶液染色45 min；倒置、風干后在倒置顯微鏡下隨機選取5個20倍物鏡視野計數染色細胞數目。實驗重復3次。

1.5 雙病毒共感染HUMSCs聯合低劑量5-FU對裸鼠肝癌皮下移植瘤的作用觀察 建立BALB/c裸鼠HepG2移植瘤模型。收集對數生長期HepG2細胞，冷PBS洗2次，調整細胞密度為2.5×107/mL，取200 μL細胞懸液接種于小鼠右前肢根部背側皮下，建立肝癌移植瘤模型。接種后每天測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。待腫瘤生長至200～300 mm3時，將小鼠分為空白組、對照組、5-FU組、慢病毒+5-FU組、雙病毒+5-FU組5組各5只，分別向小鼠尾靜脈注射PBS、HUMSCs、5-FU、慢病毒感染的HUMSCs和5-FU、雙病毒共感染的HUMSCs和5-FU;聯用5-FU的治療組從HUMSCs注射后第3天開始腹腔注射藥物，10 mg/kg，連續給藥5 d。自開始治療之日起，每隔3 d用游標卡尺測量各組小鼠移植瘤模型的腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積。相對腫瘤體積比(RTV)=Vt/V0(V0為治療開始時的體積，Vt為每次測量的體積)，腫瘤抑制率=(1-治療組RTV/空白組RTV)×100%。

1.6 腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯用對肝癌細胞的作用觀察 取對數生長期HepG2細胞，以1.5×105/mL接種于6孔板上的其中4個孔，培養1～2 h待細胞沉于孔板底部后，其中2孔按100 MOI的感染復數分別加入腺病毒Ad-hTERTp-IL24和對照病毒Ad-Track，再分別加入低劑量5-FU(終濃度2 μg/mL)，另外2孔分別加入等體積PBS(空白組)和低劑量5-FU(終濃度2 μg/mL)，37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養。培養48 h后，收集細胞，使用BD AnnexinⅤ-PE試劑盒檢測細胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察細胞。正常細胞無染色，凋亡細胞和壞死細胞呈紅色熒光，根據熒光強弱判斷凋亡發生的程度。

2 結果

2.1 雙病毒共感染前后HUMSCs向腫瘤細胞的趨化作用比較 結晶紫染色顯示，對照組、慢病毒感染HUMSCs組和雙病毒共感染HUMSCs組向HepG2細胞遷移的HUMSCs細胞數量均在60個左右，三組間比較無明顯差異。

2.2 雙病毒共感染HUMSCs聯合低劑量5-FU的抑瘤作用 治療后第6天，雙病毒+5-FU組的平均腫瘤體積為180 mm3，空白組的平均腫瘤體積為400 mm3，兩組比較P<0.01。且隨著治療時間的延長，這一趨勢更為明顯。初始治療后第21天，雙病毒+5-FU組的腫瘤抑制率為70.8%，高于慢病毒+5-FU組(23.2%)和5-FU組(21.4%)，見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 雙病毒共感染HUMSCs聯用低劑量5-FU對HepG2移植瘤生長的抑制作用

2.3 腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯用誘導肝癌細胞發生凋亡 熒光顯微鏡下可見，空白組幾乎沒有紅色熒光，Ad-hTERTp-IL24聯合5-FU組紅色熒光非常明顯，熒光強度明顯強于Ad-Track+5-FU組和5-FU組。

3 討論

大多數肝癌患者伴隨基礎的肝臟疾病，如肝硬化、肝功能代償失調，手術切除效率低，放療和化療的效果差，病死率極高。基因靶向治療是惡性腫瘤治療中最有發展前景的領域之一，其中腺病毒的基因治療在臨床試驗中的應用最為廣泛[10～12]。由于腺病毒宿主范圍廣，可有效感染多種靶細胞，包括分裂和非分裂細胞，而其基因組游離于細胞基因組之外，可短期高效地表達目的基因，其已經應用于多種癌癥的治療研究。但腺病毒的基因治療存在缺乏靶向性、免疫原性等問題。HUMSCs具有在體內向炎癥損傷及腫瘤部位歸巢、來源廣泛、擴增迅速、外源基因導入高效、低免疫原性等優勢[1]，在基因治療中呈現出廣闊的應用前景。

我們的前期研究顯示，在HepG2肝癌移植瘤模型小鼠體內，病毒感染的HUMSCs可以選擇性地歸巢于腫瘤部位[13]。本研究基于腺病毒基因治療和HUMSCs腫瘤歸巢的特性，設計了一種以HUMSCs為載體的靶向肝癌的腺病毒治療體系。5-FU是臨床治療肝癌常用的化療藥物，我們將其與腺病毒靶向治療體系聯用以增加療效，觀察對HepG2肝癌移植瘤模型小鼠的抑瘤效應。首先采用組織塊接種法分離HUMSCs，利用PCR、重疊PCR、酶切、連接等分子生物學技術構建慢病毒表達質粒LentiR.E1A和腺病毒穿梭質粒pAd-hTERTp-IL24，并成功包裝出了慢病毒和腺病毒共感染HUMSCs。利用Transwell試驗觀察雙病毒感染對HUMSCs向HepG2細胞趨化作用的影響。關于HUMSCs對肝癌HepG2細胞的趨化性已有報道，在HepG2細胞條件培養基的作用下，大量HUMSCs向其遷移，且呈細胞濃度依賴性；另外慢病毒感染HUMSCs后，對其遷移特性并無顯著影響[13]。本研究結果顯示，雙病毒共感染后HUMSCs向HepG2細胞的趨化作用沒有改變。簡言之，腺病毒與慢病毒LentiR.E1A共感染HUMSCs并不影響其體內外向腫瘤部位歸巢的能力。為了驗證該治療體系的治療效果，我們建立了BALB/c裸鼠HepG2肝癌移植瘤模型，經尾靜脈注射雙病毒共感染的HUMSCS并聯合低劑量5-FU，結果顯示，該聯合方案對BALB/c裸鼠HepG2移植瘤的生長具有明顯抑制作用，優于單獨應用的治療效果。利用BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡試劑盒檢測腺病毒Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯用誘導肝癌細胞凋亡情況，通過熒光顯微鏡觀察熒光強弱來判斷凋亡發生的程度。結果顯示，腺病毒Ad-hTERTp-IL24聯合5-FU組紅色熒光非常明顯，與該腺病毒作用體內腫瘤微環境對HepG2移植瘤生長的抑制作用結果一致[14]。

綜上所述，我們建立了以HUMSCs為載體的腺病毒基因治療體系，即利用E1A基因修飾的HUMSCs復制和包裝出特異治療基因(由hTERTp啟動子驅動的抑瘤基因IL-24)的腺病毒。復制缺陷的腺病毒感染E1A基因修飾的HUMSCs后可在細胞中復制包裝，最終釋放腺病毒顆粒；在HepG2肝癌移植瘤模型小鼠體內，病毒感染的HUMSCs可選擇性向腫瘤部位歸巢，隨著腺病毒的大量復制，HUMSCs最終被裂解，并在腫瘤周圍釋放攜帶由hTER啟動子驅動的特異抑瘤基因IL-24的腺病毒顆粒，感染腫瘤細胞后，因為腫瘤細胞內hTERT啟動子具有較高的轉錄活性，可以特異高效地啟動IL-24基因的表達，發揮其抗腫瘤作用；當與5-FU聯合應用時抑瘤作用更顯著。該靶向治療體系既解決了腺病毒載體缺乏靶向性的問題，又保留其高效的基因轉導能力，并利用HUMSCs向微小轉移灶歸巢的能力，為肝癌治療特別是轉移灶的治療提供了一個安全、有效、靶向性好的基因導入體系。

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Effect of targeted gene therapeutic system with HUMSCs as vectors combined with 5-FU on HepG2 exnograft tumor of nude mice

KONGFanni1,ZHAJianying,YANGYuanyuan,LUYang,LIZhenzhen,ZHANGYanjun

(1ChineseAcademyofMedicalSciencesHospitalofBloodDiseases&InstituteofHematology,Tianjin300020,China)

Objective To construct a targeted gene therapy system with human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) as vectors, and to observe its therapeutic effect on nude mice HepG2 xenografts combined with low-dose 5-fluorouracil (5-FU). Methods HUMSCs were isolated from fresh sterile neonatal umbilical cord by tissue adherent method. We used the methods of PCR, overlap PCR, and restriction enzyme cleavage and linkage to construct the lentiviral expression vector pLentiR.E1A and the adenovirus shuttle vector pAd-hTERTp-IL24. The migratory ability to HepG2 cells of HUMSCs co-infected by lentivirus and adenovirus in vitro was determined by Transwell experiment. HepG2 transplanted tumor model was established in BALB/c nude mice by subcutaneous inoculation. The tumor-bearing mice were divided into five groups and the groups were separately injected with PBS, HUMSCs, low-dose 5-FU, HUMSCs infected by lentivirus combined with ow-dose 5-FU, and HUMSCs co-infected by double virus combined with 5-FU. The anti-tumor effect of each group was compared. The apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by adenovirus Ad-hTERTp-IL24 and low-dose 5-FU was detected by BD Annexin-Ⅴ-PE apoptotic kit.Results The lentiviral expression vector pLentiR.E1A and adenovirus expression vector pAd-hTERTp-IL24 were successfully constructed and the lentivirus LentiR.E1A and adenovirus Ad-hTERTp-IL24 were successfully packaged. Transwell experiment showed that there was no significant change in the migratory ability of HUMSCs to tumor cells after co-infected by double virus. In treatment of HepG2 exnograft tumor of nude mice, the tumor volume was significantly smaller in the treatment group than in the control group (P<0.01). Ad-hTERTp-IL24 combined with low-dose 5-FU induced tumor apoptosis in the tumor microenvironment, and its fluorescence intensity was stronger than that of the other treatment control groups.Conclusion The targeted gene therapeutic system based on HUMSCs is successfully established, and adenovirus Ad-hTERTp-IL24 combined with low-dose 5-FU have significant inhibitory effect on HepG2 exnograft tumor of nude mice.

human umbilical cord mesenchymal stem cells; adenovirus; targeted gene therapeutic system; 5-fluorouracil; HepG2 exnograft tumor

國家科技重大專項基金資助項目(2012ZX09102301-015)。

孔凡妮(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤藥理學。E-mail: fannikong@163.com

張硯君(1977-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向為腫瘤藥理學。E-mail: junjunfriend@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.003

R394.6

A

1002-266X(2017)26-0009-04

2017-02-04)