肢體遠程與局部缺血預處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷影響的比較

林威威，施小彤，謝永果，王維，陳錫華，張輝(廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧530000)

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肢體遠程與局部缺血預處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷影響的比較

林威威，施小彤，謝永果，王維，陳錫華，張輝
(廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧530000)

目的 比較局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷的影響。方法 將40只大鼠隨機分為對照組、缺血組、局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組各10只。對照組接受假手術，缺血組夾閉胸背動脈3 h后恢復血流灌注1 h，局部缺血預處理組夾閉肌皮瓣胸背動脈進行預處理，肢體缺血預處理組夾閉右股動脈進行預處理。采用缺血10 min后恢復血流灌注10 min進行預處理，預處理結束30 min后再重復缺血組操作。檢測缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、再灌注1 h(T2)后各組血清一氧化氮(NO)、內皮素(ET)水平，術后第5天光鏡下觀察背闊肌皮瓣的組織形態學變化。結果 與缺血組比較，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組在T1和T2時間點血清NO水平升高、ET水平降低(P均<0.05)，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。與缺血組比較，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組術后第5天肌皮瓣組織病理學損傷減輕，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組的病理學變化比較無明顯差異。結論 局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理均能減輕大鼠肌皮瓣的缺血再灌注損傷，對肌皮瓣具有保護作用。

缺血再灌注損傷；缺血預處理；移植皮瓣；背闊肌肌皮瓣；胸背動脈；股動脈；大鼠

缺血再灌注損傷(IRI)是指缺血的器官和組織恢復血流灌注后，缺血性損傷進一步加重的現象[1]。背闊肌肌皮瓣是外科手術最常選用的移植皮瓣[2]，如何采取安全有效的措施減少因缺血再灌注損傷導致的肌皮瓣缺血壞死，對于提高手術療效、改善患者預后具有重要意義。局部缺血預處理是指某種器官受短暫的缺血刺激后產生的對隨后較長時間缺血損害的耐受性。近年研究顯示，局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理均可減輕各器官和組織的缺血再灌注損傷[3～5]，但二者的效果比較尚未見報道。血管內皮細胞是血液和組織液之間的屏障，分泌多種活性物質來調節血管壁張力，在維持血管正常功能方面發揮重要作用[6]。一氧化氮(NO)和內皮素(ET)是由血管內皮細胞分泌的調節血管舒縮的重要因子，其血清水平能夠反映血管內皮細胞的生理功能和受損程度[7]。2015年5月～2016年3月，我們通過建立大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷模型，從保護血管內皮細胞的角度，比較局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理對肌皮瓣缺血再灌注損傷的影響，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠40只，體質量250～300 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，適應性飼養1周，禁食12 h，自由飲水。ELISA檢測試劑盒(上海心語生物科技有限公司)，酶標儀(BioTek Instruments，美國)，光學顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動物分組與模型制備 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、缺血組、局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組各10只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取俯臥位，從大鼠右側背部外側肋弓下緣至腋窩做一縱形切口，切開皮膚，分離背闊肌，結扎肋間動脈穿支，保留胸背動脈為惟一的供血血管，將4-0絲線穿于胸背動脈下。穩定10 min后，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組分別用無損傷血管夾夾閉胸背動脈、右股動脈做缺血預處理，以背闊肌完全變為青紫為缺血成功的標志；缺血10 min松開血管夾，恢復灌流10 min，重復3個循環，穩定30 min后再進行缺血3 h操作。缺血組夾閉胸背動脈3 h后恢復血流。對照組在胸背動脈處僅穿線，不結扎。整個過程保持大鼠肛溫在36～37 ℃。

1.3 血清NO、ET檢測 于缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、恢復灌流后1 h(T2)分別于左股靜脈采集靜脈血0.5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，使用酶標儀采用ELISA法測定NO和ET水平。

1.4 大鼠背闊肌組織的病理形態學觀察 術后第5天切取大鼠背闊肌中間部分組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下(400倍)觀察背闊肌纖維、肌細胞和細胞核的病理形態學。

2 結果

2.1 各組血清NO、ET水平比較 各組T0時血清NO、ET水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。與T0時比較，T1和T2時缺血組、局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；與T1時比較，T2時缺血組、局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；對照組各時間點比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。與對照組比較，T1和T2時缺血組、局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；與缺血組比較，局部缺血預處理組、肢體缺血預處理組NO水平升高，ET水平降低(P均<0.05)；局部缺血預處理組與肢體缺血預處理組各時間點NO、ET比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點血清NO、ET水平比較

注：與同組T0時間點比較，aP<0.05；與同組T1時間點比較，bP<0.05；與對照組同一時間點比較，cP<0.05；與缺血組同一時間點比較，dP<0.05。

2.2 各組背闊肌病理組織切片觀察 對照組肌纖維均勻，染色均一，細胞核形狀正常，細胞結構完整；缺血組肌纖維腫脹明顯，肌纖維斷裂，部分細胞核消失，細胞部分結構破壞；局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組肌纖維輕度腫脹，染色均一，肌肉纖維斷裂較少，細胞核形狀正常，輕度腫脹，細胞結構完整，兩者的病理形態學變化無明顯差異，均較缺血組明顯減輕。

3 討論

缺血再灌注損傷是指繼缺血本身對組織造成損傷后，重新恢復的血液供應再次對組織內的細胞造成損傷，可引起組織細胞的壞死和凋亡。其發生機制還不是很清楚，目前認為內皮細胞屏障損傷、氧自由基損傷、NO生物利用率的減少、Ca2+超載、細胞炎癥、細胞凋亡、微循環障礙、血管通透性和滲漏的增加均在其中起到了重要的作用[8]。

缺血預處理是一種通過多次間斷短暫的重復缺血再灌注來減輕隨后持續缺血損傷的方法，可以減輕器官和組織的缺血再灌注損傷，可分為局部缺血預處理和遠程缺血預處理。局部缺血預處理是指某種器官受短暫的缺血刺激后產生的對隨后較長時間缺血損害的耐受性。Mounsey等[9]建立豬的背闊肌模型，行缺血預處理后給予4 h的缺血，發現背闊肌存活面積明顯提高，證實局部缺血預處理能夠減少肌肉缺血壞死。Lintz等[10]通過檢測血清中的細胞質酶和細胞膜的降解產物來檢驗局部缺血預處理對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用，發現局部缺血預處理能很好地避免缺血肌肉的糖元分解，保護肌肉免于損傷。遠程缺血預處理是在局部缺血預處理基礎上提出的，是指給予肢體或者其他遠隔器官或組織短時間的非致死的缺血刺激，可以增加靶器官或組織對長時間缺血的耐受性，對靶器官和組織產生保護作用。近年來，有學者[11]提出肢體遠程缺血預處理的概念。Kuntscher等[12]建立大鼠上腹部的脂肪皮瓣缺血再灌注模型，夾閉大鼠后肢股動脈行缺血預處理，發現預處理組肌皮瓣壞死面積減少，認為肢體缺血預處理能夠對大鼠腹部任意皮瓣缺血再灌注損傷起到保護作用。Krag等[13]采用止血帶對豬的后肢進行缺血預處理，然后對豬的背闊肌皮瓣進行4 h缺血和7 h再灌注，發現肢體遠程缺血預處理可以減輕肌皮瓣的缺血再灌注損傷。本研究發現，與缺血組相比，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組肌纖維斷裂、肌細胞腫脹程度及肌細胞核的病理形態學改變明顯減輕。說明局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理均可以減輕大鼠背闊肌肌皮瓣的缺血再灌注損傷。

NO是一種生物信使分子，廣泛分布于生物體內，具有舒張血管平滑肌的作用。血管內皮細胞可以通過一氧化氮合成酶(NOS)將L-精氨酸轉化為瓜氨酸來合成NO，合成的NO作用于血管壁中平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶，增加環磷酸鳥苷(cGMP)生成，引起血管平滑肌細胞舒張，從而達到保護細胞和組織的目的[14]。ET是由21個氨基酸殘基組成的活性多肽，是迄今所知最強的縮血管物質，可以激活鈣通道增加Ca2+內流，促進血管平滑肌細胞收縮，繼而引起血管收縮，血流量減少，細胞水腫，造成血管內皮細胞損傷[15]。NO和ET是維持血管內皮功能的重要生物活性分子。正常情況下，血管舒張因子NO釋放和血管收縮因子ET釋放處于相對平衡狀態，以NO略占優勢，以便于保持血流的流動；當組織遭遇長時間的缺血損害時，血管內皮功能發生障礙，引起內皮依賴的舒血管因子NO減少，內皮依賴的縮血管因子ET增多，NO/ET比例失衡，導致血管痙攣、異常收縮、加重組織壞死。因此，可以通過檢測NO和ET的含量間接評價血管內皮功能。Jankauskas等[16]在抗氧化劑對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護作用的研究中，觀察到缺血再灌注可引起大鼠腎臟血管收縮，血管阻力增加，腎血流量減少，內皮細胞破壞，減少了NO的生成，導致腎臟功能的衰竭，得出內皮細胞的功能障礙在組織的缺血再灌注損傷中起著重要作用。本研究結果顯示，在缺血3 h和再灌注1 h，缺血組血清NO水平降低，ET水平升高；術后5 d觀察病理組織學形態，發現大鼠的肌肉纖維腫脹明顯，大部分肌肉纖維斷裂及部分細胞核消失，說明缺血3 h再灌注1 h對血管內皮細胞功能造成了損傷，繼而加重了大鼠背闊肌皮瓣缺血壞死。與缺血組相比，局部缺血預處理組和肢體缺血預處理組血清NO水平降低幅度及ET水平升高幅度均降低，兩組間血清NO、ET比較無統計學差異。說明局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理均可以減輕缺血再灌注對血管內皮細胞的損害，進而減輕大鼠背闊肌肌皮瓣的缺血再灌注損傷。

綜上所述，局部缺血預處理和肢體遠程缺血預處理均能減輕大鼠肌皮瓣的缺血再灌注損傷。局部缺血預處理是直接在血管蒂上進行缺血預處理操作，在臨床中可能會損傷吻合的血管并延長手術時間，給臨床操作帶來不便；而肢體遠程缺血預處理由于操作簡便，無損傷性，且不延長手術時間，因此具有更好的臨床應用價值。

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廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目(S201411-02)。

施小彤(E-mail: hbb38@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.010

R622

A

1002-266X(2017)26-0035-03

2016-12-26)