食管胃交界部腺癌組織中Cx43、MT1-MMP表達及意義

苗杰，韓永強，邸永輝，付琳，李輝(河北醫科大學附屬邢臺人民醫院，河北邢臺054001)

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食管胃交界部腺癌組織中Cx43、MT1-MMP表達及意義

苗杰，韓永強，邸永輝，付琳，李輝
(河北醫科大學附屬邢臺人民醫院，河北邢臺054001)

目的 觀察食管胃交界部腺癌組織中縫隙連接蛋白43(Cx43)、膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的表達，探討其與腫瘤發生、發展及轉移的關系。方法 采集108例食管胃交界部腺癌組織(腫瘤組)、30例癌旁正常黏膜組織(正常組)、40例異型增生胃黏膜組織(增生組)。應用免疫組化法檢測Cx43、MT1-MMP表達，并分析二者異常表達與患者臨床病理資料的關系，采用Pearson相關分析法分析Cx43與MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中表達的相關性。結果 Cx43在正常組、增生組和腫瘤組中的陽性表達率分別為86.7%、52.5%、31.5%，正常組高于增生組和腫瘤組，增生組高于腫瘤組(P均<0.05)；MT1-MMP在正常組、增生組和腫瘤組中的陽性表達率分別為10.0%、27.5%、80.6%，正常組低于增生組和腫瘤組，增生組低于腫瘤組(P均<0.05)。食管胃交界部腺癌患者中，腫瘤組織高/中分化、浸潤深度未及漿膜層、無淋巴結轉移者的Cx43陽性率高于低/未分化、浸潤深度侵及漿膜層、有淋巴結轉移者；腫瘤組織低/未分化、浸潤深度侵及漿膜層、有淋巴結轉移者的MT1-MMP陽性率高于高/中分化、浸潤深度未及漿膜層、無淋巴結轉移者(P均<0.05)。Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達呈負相關(r=-0.221，P<0.05)。結論 食管胃交界部腺癌組織中Cx43表達降低、MT1-MMP表達升高，二者在食管胃交界部腺癌的發生、發展過程中起重要作用。

食管胃交界部腺癌；縫隙連接蛋白43；膜型基質金屬蛋白酶

食管胃交界部腺癌是指發生在食管胃交界區域內的腺癌，從解剖學的角度包括食管遠端腺癌和胃賁門腺癌。近年來，全世界范圍內食管胃交界部腺癌的發病比例逐年上升[1]。縫隙連接是細胞之間普遍存在的一種聯系方式，參與細胞間能量和信息的傳遞、電信號傳導的電偶聯、細胞間物質交換的代謝偶聯，在調節細胞增殖分化、凋亡及內環境的穩定等過程中發揮重要作用。該通道的主要成分是縫隙連接蛋白(Cx)。Cx43基因被認為是非突變型抑癌基因[2]，其表達異常及其導致的細胞間隙連接通訊(GJIC)功能改變與多種惡性腫瘤的發生發展、浸潤轉移有關[3]。膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中重要的一員，能降解細胞外基質及血管基膜，從而促進腫瘤細胞浸潤和血管形成。作為兩種重要的細胞間和細胞間質相互作用因子，Cx43與MT1-MMP在惡性腫瘤中表達的關系尚無報道。本研究通過觀察Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達情況，探討其與腫瘤發生、發展及轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年12月邢臺市人民醫院胃鏡活檢和胃體外科手術切除標本，其中食管胃交界部腺癌標本108例(腫瘤組)，癌旁正常黏膜組織30例(正常組)，異型增生的黏膜組織40例(增生組)。腫瘤組男69例、女39例，年齡38～79歲、中位年齡65歲；組織學高分化57例，低分化51例，浸潤深度侵及黏膜層及黏膜下層組49例，侵及肌層、漿膜層組59例；合并淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移61例。患者術前均未接受放化療和其他治療。正常組取自腫瘤組癌旁大于2 cm處正常組織。增生組男26例，女14例，年齡28～72歲，中位年齡62歲。三組的性別、年齡具有可比性。

1.2 檢測方法 采用免疫組化法。將組織標本用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切4 μm厚切片，脫蠟至水。加入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復，3%去離子過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶；分別滴加Cx43兔抗人多克隆抗體(1∶200)和MT1-MMP兔抗人單克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 由兩名高年資病理科醫師采用雙盲法確認。Cx43陽性表達顆粒呈黃色或棕褐色，定位于細胞質及細胞膜上，根據染色強度及陽性細胞數進行半定量分析判定。在染色均勻的區域，選取5個高倍視野(×400)。首先以著色強度評分，無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，棕色為3分；再按陽性細胞百分率評分，<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩評分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽性。MT1-MMP陽性表達顆粒呈黃色或棕褐色，先以染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按陽性細胞百分比評分，無陽性細胞為0分，陽性細胞1～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩評分相乘，1～2為陰性，≥3為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組Cx43、MT1-MMP陽性表達率比較 Cx43蛋白在正常組、增生組、腫瘤組的陽性表達率分別為86.7%(26/30)、52.5%(21/40)、31.5%(34/108)，正常組高于增生組和腫瘤組，增生組高于腫瘤組(P均<0.05)。MT1-MMP在正常組、增生組、腫瘤組的陽性表達率分別為10.0%(3/30)、27.5%(11/40)、80.6%(87/108)，正常組低于增生組和腫瘤組，增生組低于腫瘤組(P均<0.05)。

2.2 不同臨床病理參數食管胃交界部腺癌患者腫瘤組織中Cx43、MT1-MMP陽性率比較 食管胃交界部腺癌患者中，腫瘤組織高/中分化、浸潤深度未侵及漿膜層、無淋巴結轉移者的Cx43陽性率高于低/未分化、侵及漿膜層、有淋巴結轉移者；腫瘤組織低/未分化、浸潤深度侵及漿膜層、有淋巴結轉移者的MT1-MMP陽性率高于高/中分化、未侵及漿膜層、無淋巴結轉移者(P均<0.05)。不同性別、不同年齡患者的Cx43、MT1-MMP陽性率比較無統計學差異(P均>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數患者食管胃交界部腺癌組織中Cx43、MT1-MMP陽性率比較

2.3 食管胃交界部腺癌組織中Cx43與MT1-MMP表達的相關性 108例食管胃交界部腺癌組織中，Cx43和MT1-MMP均陽性23例，均陰性10例，Cx43陽性、MT1-MMP陰性11例，Cx43陰性、MT1-MMP陽性64例。在腫瘤組織中Cx43與MT1-MMP的表達呈負相關(r=-0.221，P<0.05)。

3 討論

細胞通訊是指生物體細胞與細胞間以化學物質或電信號傳導信息的傳導機制，是維持機體正常組織結構和功能的基礎[4]。細胞間的連接有緊密連接、橋粒和縫隙連接等多種結構，其中縫隙連接通道是細胞間直接進行物質交流的惟一膜通道結構，其結構基礎為相鄰細胞膜上連接子的相互連接。一個連接子由6個啞鈴型蛋白單體聚合環繞而成，該蛋白亞單體即為Cx。GJIC允許相對分子質量小于1×103的小分子物質通過，完成細胞間信息、能量和物質交換功能，對細胞的內環境穩定、新陳代謝、增殖分化等過程起著重要的調控作用。Cx43是Cx基因家族中數量最多、分布最廣且最為重要的成員，除分化的紅細胞、骨骼肌及成熟精子細胞外，在人類幾乎所有的組織和細胞中都有表達。它是縫隙連接通道的重要組成部分，其組成的連接子在質膜上以成簇形式出現，形成間隙連接斑，在細胞間信號傳遞中發揮著重要作用，其數量與GJIC的功能密切相關。Cx43在皮膚疾病、神經系統[5]及心血管疾病[6]的生理病理變化過程中發揮重要作用。近年研究發現，Cx43基因是一種抑癌基因，可能通過介導細胞外環境旁分泌信號分子的釋放等途徑，對絕大多數腫瘤細胞的生長起抑制作用。在許多腫瘤中Cx43基因失活，表達減少或缺失，造成GJIC功能減退，細胞間信號傳遞受到影響，造成內環境不穩定，為腫瘤細胞發生惡性轉化提供了條件[7]。已有報道，Cx43在前列腺癌[8]、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌[9]等多種腫瘤中表達下降或缺失。本研究顯示，食管胃交界部腺癌組織中Cx43的表達低于正常黏膜組織，在高/中分化、未侵及漿膜層及無淋巴結轉移癌組中的表達高于低/未分化、侵及漿膜層及淋巴結轉移組。說明Cx43參與了食管胃交界部腺癌的發生和進展，影響其生物學行為并與其惡性程度相關。

MMPs是一個Zn2+依賴的、具有廣泛底物特異性的蛋白水解酶大家族。MT1-MMP是MMPs家族重要成員，它不但可以直接降解Ⅰ型和Ⅱ型膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、玻黏蛋白和蛋白多糖[10]等細胞外基質成分，而且還可以激活MMP-2降解基質、促進VEGF等多種促血管生長因子表達、穿透血管壁和淋巴管壁以及幫助腫瘤細胞逃避宿主的免疫反應，促進腫瘤細胞的浸潤和轉移。近年研究發現，MT1-MMP在多種腫瘤中過表達與腫瘤發生、進展密切相關，如神經母細胞瘤[11]、頭頸部癌、膀胱癌、乳腺癌[12]等。本研究結果顯示，MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的陽性表達率為80.6%，高于正常食管胃交界部組織，MT1-MMP在低/未分化、侵及漿膜層及有淋巴結轉移的食管胃交界部腺癌組織中的表達高于高/中分化、未侵及漿膜層及淋巴結無轉移組。說明MT1-MMP表達越高，EGJA浸潤程度就越深，淋巴結轉移的可能性就越大。提示MT1-MMP可能促進了食管胃交界部腺癌的發生、發展和轉移。

本研究顯示，Cx43與MT1-MMP在食管胃交界部腺癌組織中的表達呈負相關。提示Cx43和MT1-MMP蛋白可能相互作用，參與了食管胃交界部黏膜上皮細胞癌變的發生及發展。De Bock等[13]研究發現，在急性炎癥時，MMP可以與Cx43的C-末端形成連接，并影響后者的縫隙通道功能。Liew發現給大鼠靜脈注射TNF-α后，大動脈組織內MMP-2水平升高并伴隨Cx40的下降。Givvmani等[14]發現，TIMP-2基因敲除小鼠的心臟壓力負荷與MMP-9、MT1-MMP水平升高密切相關，并且導致心內膜Cx37和Cx43水平明顯下降，進而加重心功能異常。但Cx43與MT1-MMP在腫瘤中的具體相互作用機制尚有待研究。

綜上所述，Cx43蛋白的低表達和MT1-MMP的高表達，均可能參與了食管胃交界部腺癌的侵襲和轉移過程，對它們相互作用機制的進一步深入研究，有望為該腫瘤的治療提供新思路。

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