Piscidinol A對人肝癌HepG-2細胞增殖、凋亡的影響

肖雪琴，張敏鴻，劉海，楊建瓊(贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州 34000；贛南醫學院)

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Piscidinol A對人肝癌HepG-2細胞增殖、凋亡的影響

肖雪琴1，張敏鴻1，劉海2，楊建瓊1
(1贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州 341000；2贛南醫學院)

目的 探討匹西狄醇A(Piscidinol A)對人肝癌HepG-2細胞增殖及凋亡的影響。方法 取對數生長期經胰酶消化后的HepG-2細胞，培養24 h后分為藥物組及對照組，藥物組加入不同濃度Piscidinol A (6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，對照組加入等體積的含10%胎牛血清RPMI1640培養液，12、24、48 h后采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，計算Piscidinol A的半數抑制濃度(IC50)值；于熒光顯微鏡下通過Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標記法及流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blotting法檢測B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x(Bax)蛋白表達。結果 藥物組Piscidinol A作用后HepG-2細胞增殖受到抑制且呈量效和時效關系，24 h時IC50值為24.90 mg/L；細胞凋亡染色顯示，藥物組有典型的細胞凋亡形態出現。藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細胞24 h后，細胞凋亡率分別為11.83%、17.49%、21.72%、34.17%、48.51%，對照組為7.23%，隨著藥物濃度增大，藥物組細胞凋亡率相應升高，與對照組相比，P均<0.05。藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細胞24 h后，細胞凋亡相關蛋白Bax表達量分別為0.29、0.33、0.35、0.39、0.43 μg/μL，對照組為0.24 μg/μL，藥物組隨著Piscidinol A濃度升高，Bax蛋白表達增加，與對照組相比，P均<0.05。結論 Piscidinol A能抑制人肝癌HepG-2細胞增殖并誘導細胞凋亡。

肝腫瘤；HepG-2細胞；匹西狄醇A；細胞增殖；細胞凋亡;B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x

匹西狄醇A(Piscidinol A)為從蕓香科植物黃柏中分離得到的三萜類化合物[1，2]，具有廣泛的藥理活性。研究表明，諸多三萜化合物具有化學預防、細胞毒、分化誘導及抗侵襲轉移等相關抗腫瘤活性[3，4]。Piscidinol A為甘遂烷型四環三萜類化合物，國內外有關Piscidinol A的藥理作用研究表明，Piscidinol A具有免疫抑制作用[5]，可抑制小鼠腹腔巨噬細胞中NO產生；對P388白血病細胞、KB人口腔表皮樣癌細胞[6]和兩種結腸癌LoVo、CT-26細胞[7]具有細胞毒作用。目前，有關Piscidinol A的抗腫瘤活性研究較少，除上述細胞的體外增殖抑制作用外未見其他抗腫瘤作用機制研究報道。2015年11月，我們以人肝癌HepG-2細胞為體外抗腫瘤實驗模型，探討Piscidinol A對HepG-2腫瘤細胞增殖、凋亡的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 流式細胞儀(美國BD公司)；智能型倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司)；化學發光成像系統(美國BIO-RAD公司)；連續光譜多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；電子天平(美國丹佛)；CO2培養箱(美國Thermo公司)。Piscidinol A為本課題組從黃柏中提取分離得到，純度為99.5%；胎牛血清和RPMI1640培養基(Gibco公司)；Bax antibody(美國Cell signaling公司)；細胞凋亡熒光Hoechst 33258檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展技術有限公司)；Pierce Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國Thermo公司)；Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit(美國BD公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT,Sigma公司)；人肝癌HepG-2細胞(贛南醫學院第一附屬醫院臨床醫學研究中心保藏)。

1.2 人肝癌HepG-2細胞培養 于37 ℃、5%CO2條件下，用RPMI1640培養液(含10%胎牛血清)傳代培養人肝癌HepG-2 細胞，貼壁細胞用0.25%胰酶-EDTA消化，實驗用細胞均處于對數生長期。

1.3 Piscidinol A作用后HepG-2細胞增殖抑制率的測算 采用MTT法。取對數生長期經胰酶消化后的HepG-2細胞，以4×103/孔接種至96孔板培養24 h，分為藥物組及對照組，藥物組加入含不同濃度藥物(Piscidinol A 6.25、12.5、25、50、100 mg/L，含DMSO體積分數小于0.1%)的培養液200 μL，對照組加入等體積的含10%胎牛血清RPMI1640培養液，置培養箱中培養，分別于細胞培養12、24、48 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，棄上清，加入150 μL的DMSO溶液振蕩至藍色晶體完全溶解，于酶標儀570 nm(參考波長630 nm)處測定吸光度值(A)，計算藥物對細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=[1-實驗組(A570-A630)/對照組(A570-A630)]×100%。計算Piscidinol A的半數抑制濃度(IC50)值。

1.4 Piscidinol A作用后HepG-2凋亡細胞形態觀察 取HepG-2細胞以1×105/孔接種至6孔培養板，培養24 h后，分為藥物組及對照組，藥物組加入含不同濃度 Piscidinol A(6.25、12.5、25、50、100 mg/L)培養液2 mL，對照組加入等體積含10%胎牛血清RPMI1640培養液，置培養箱培養24 h后吸棄上清，用冷Buffer A緩沖液洗滌2次，加入4%甲醛溶液1 mL于4 ℃固定10 min，吸去固定液，用緩沖液洗滌2次，每孔加入Hoechst 33258工作液100 μL，于室溫下染色10 min，用水沖洗后晾干，置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態。

1.5 Piscidinol A作用后HepG-2細胞凋亡率測算 取HepG-2細胞接種于6孔板中，24 h后藥物組加入含不同濃度Piscidinol A(6.25、12.5、25、50、100 mg/L)培養液2 mL，對照組加入等量的含10%胎牛血清RPMI1640培養液，藥物作用24 h后收集細胞，用預冷PBS洗滌，重懸于Binding buffer溶液并使細胞濃度為1×106/mL。于100 μL細胞懸液中分別加入Annexin Ⅴ-FITC及50 μg/mL PI染色液各5 μL，置室溫避光孵育15 min后加入Binding buffer 200 μL，混勻，1 h內用流式細胞儀進行檢測并計算細胞凋亡率，凋亡細胞為Annexin V陽性細胞。

1.6 Piscidinol A作用后HepG2細胞中Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。細胞毒染結束后，RIPA Buffer裂解液冰上裂解細胞30 min，離心收集上清，上清中加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，冷卻后上樣進行SDS-PAGE電泳后濕轉；5% BSA 4 ℃搖床封閉30 min，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3×10 min；加入對應二抗，室溫搖床孵育1.5 h，TBST緩沖液洗膜3×10 min；PVDF膜上滴加適量化學發光試劑，于化學發光成像系統曝光，攝取圖片后分析實驗結果。

2 結果

2.1 Piscidinol A作用后HepG-2 細胞的增殖抑制率 Piscidinol A對HepG-2細胞的增殖抑制率隨藥物濃度升高和時間延長而增高，呈濃度及時間依賴性，24 h時IC50值為24.90 mg/L(圖1)。

圖1 不同時點Piscidinol A作用后HepG-2細胞增殖曲線

2.2 Piscidinol A作用后HepG-2凋亡細胞形態變化 光鏡下對照組細胞呈低強度熒光，胞質舒展，細胞核染色質分布均勻；藥物組細胞生長疏散，細胞核固縮，染色質致密成斑塊狀濃集于核膜下，呈亮藍色熒光，可見凋亡小體，呈典型凋亡細胞形態。

2.3 Piscidinol A作用后HepG-2細胞凋亡率比較 藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細胞24 h，細胞凋亡率分別為11.83%、17.49%、21.72%、34.17%、48.51%，對照組為7.23%，隨藥物濃度增大，藥物組細胞凋亡率相應升高，與對照組相比,P均<0.05。

2.4 Piscidinol A作用后HepG-2細胞凋亡相關蛋白Bax表達比較 藥物組6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Piscidinol A作用HepG-2細胞24 h，Bax蛋白表達量分別為0.29、0.33、0.35、0.39、0.43 μg/μL，對照組為0.24 μg/μL，藥物組隨著藥物濃度升高， Bax蛋白表達增加，與對照組相比差異有統計學意義(P均<0.05)。

3 討論

Piscidinol A具有較強的藥理活性，文獻[5]報道Piscidinol A具有免疫抑制作用，可抑制小鼠腹腔巨噬細胞中NO的產生。日本學者Itokawa 等[6]發現Piscidinol A對P388白血病細胞和KB人口腔表皮樣癌細胞有較強的細胞毒作用；另外，從椿皮中分離得到的Piscidinol A被證實對兩種結腸癌LoVo、CT-26細胞有一定體外生長抑制作用，且呈劑量依賴性[7]。

本實驗以人肝癌HepG-2細胞作為體外抗腫瘤實驗模型，采用MTT法考察Piscidinol A對HepG-2細胞的體外抗腫瘤活性，結果發現Piscidinol A能明顯抑制HepG-2腫瘤細胞生長，呈良好的劑量依賴關系，作用24 h時IC50值為24.90 mg/L；通過Hoechst 33258凋亡染色發現經Piscidinol A處理的細胞呈明顯的形態學變化，出現典型的凋亡形態，提示 Piscidinol A具有促凋亡作用；應用流式細胞術Annexin Ⅴ-FITC/ PI雙標記法定量實驗可見隨著藥物Piscidinol A濃度的增大，細胞凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴關系，進一步表明Piscidinol A能誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡。

細胞凋亡是致病因子或異常信號誘導發生的“生理性”細胞死亡[8]，其凋亡過程伴隨著細胞內一系列化學分子信號的傳導[9，10]，凋亡細胞通過對凋亡信號的感知和一系列的變化及調控從而釋放一些蛋白，如凋亡介導因子(抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x和促凋亡蛋白Bax、Bak)[11]、Caspase家族和核酸內切酶、細胞色素C等[12]，這些釋放物在胞質中發揮作用，介導細胞凋亡。本實驗結果顯示，Piscidinol A作用于HepG- 2 細胞24 h，Bax蛋白表達較對照組增高，提示Piscidinol A誘導HepG- 2 細胞凋亡可能與促凋亡相關蛋白Bax表達增加有關。

綜上所述，Piscidinol A能抑制人肝癌HepG-2細胞增殖并誘導細胞凋亡。

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Effects of piscidinol A on proliferation and apoptosis of human liver cancer HepG-2 cells

XIAOXueqin1,ZHANGMinhong,LIUHai,YANGJianqiong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China)

Objective To investigate the effects of piscidinol A on apoptosis and proliferation of human liver cancer cell line HepG-2 and the mechanism. Methods HepG-2 cells in the logarithmic phase were cultivated for 24h and then were divided into the drug group and the control group after pancreatic enzyme digesting. The drug group was treated by different concentrations of piscidinol A (6.25, 12.5, 25, 50, and 100 mg/L) and the control group was treated by the same volume RPMI1640 culture which was contained 10% fetal bovine serum. MTT assay was applied to detect the proliferation inhibitory rate at 12, 24, and 48 h. IC50of piscidinol A was calculated, and the morphology of apoptotic cells was observed with Hoechst 33258 fluorescence staining. Flow cytometry was applied to detect apoptosis rate of HepG-2 cell by using Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining. Western blotting was used to detect the B-cell lymphoma/leukemia-2 associated x (Bax) expression in cells. Results In the drug group, piscidinol A had remarkable proliferation inhibition effect on HepG-2 cells in a dose and time-dependent manner, its IC50was 24.90 mg/L at 24 h. Most of cells presented the typical morphological changes of apoptosis under the fluorescent microscope and more effect occurred with the increasing concentration. After the cells were treated by different concentrations of piscidinol A (6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg/L) for 24 h, the apoptosis rates were 11.83%, 17.49%, 21.72%, 34.17%, and 48.51%, respectively in the drug group, versus 7.23% in the control group (allP<0.05); the apoptotic protein expression of Bax was 0.29, 0.33, 0.35, 0.39, and 0.43 μg/μL, respectively in the drug group, versus 0.24 μg/μL in the control group. The apoptosis rate and Bax protein expression increased with the increasing concentrations of piscidinol A in the drug group, and the difference was statistically significant as compared with that of the control group (allP<0.05). Conclusion Piscidinol A inhibits the proliferation and induces apoptosis of human liver cancer HepG-2 cells.

hepatoma; HepG-2 cells; piscidinol A; cells proliferation; apoptosis; B-cell lymphoma/leukemia-2 associated x

江西省衛生廳中醫藥科研基金項目(2014A114)；贛州市指導性科技計劃項目(GZ2014ZSF125)；江西省教育廳青年科學基金項目(GJJ150939)；江西省科技廳自然科學基金計劃項目(2015ZBAB205005，20161BAB215220)。

肖雪琴(1977-)，女，研究生，副主任醫師，主要研究方向為兒童腫瘤的診治。E-mail：xiaoxueqin_2004@126.com

劉海(1983-)，男，研究生，副教授，主要研究方向為天然藥物活性成分及其制劑的研究。E-mail：liuhaiuser@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.002

R735.7

A

1002-266X(2017)25-0005-03

2016-11-24)