抗SSA抗體陽性干燥綜合征患者血清miR-34、miR-500表達變化及其診斷價值

黃陽，胡赟霞，葛曉松，吳平(江南大學附屬醫院·無錫市第四人民醫院，江蘇無錫4000；無錫市人民醫院；杭州師范大學附屬醫院)

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抗SSA抗體陽性干燥綜合征患者血清miR-34、miR-500表達變化及其診斷價值

黃陽1，胡赟霞2，葛曉松1，吳平3
(1江南大學附屬醫院·無錫市第四人民醫院，江蘇無錫214000；2無錫市人民醫院；3杭州師范大學附屬醫院)

目的 觀察抗SSA抗體陽性干燥綜合征(pSS)患者血清miR-34、miR-500表達變化，并探討二者在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的臨床價值。方法 收集pSS患者75例(觀察組)，非pSS患者84例(對照組)，miRNA芯片分析兩組血清miRNA表達譜改變；并通過實時熒光定量RT-PCR進行驗證。隨后應用統計學方法分析異常表達miRNA在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的價值。結果 miRNA芯片分析發現6個上調和4個下調的miRNA，其中miR-34和miR-500表達在觀察組血清中明顯升高；實時熒光定量PCR的結果證實miR-34和miR-500在觀察組明顯上調，與對照組比較，P<0.001。受試者工作曲線分析結果顯示，觀察組miR-34對pSS診斷的AUC為0.783 (95%CI: 0.710～0.844,P<0.001)；miR-500的AUC為0.774 (95%CI: 0.701～0.837,P<0.001)。而miR-34聯合miR-500在pSS診斷中AUC為0.888(95%CI: 0.828～0.932,P<0.001)；兩者聯合診斷pSS的AUC與單一檢測比較，P均<0.05。結論 miR-34和miR-500在抗SSA抗體陽性pSS患者血清中表達升高,檢測血清miR-34和miR-500有助于抗SSA抗體陽性pSS診斷。

干燥綜合征；抗SSA抗體；微小RNA-34；微小RNA-500

原發性干燥綜合征(pSS)是一種侵犯外分泌腺體為主的系統性自身免疫病，病理主要表現為外分泌腺大量淋巴細胞浸潤和對內臟器官的浸潤。本病起病多隱匿，臨床表現多樣，病情輕重差異較大。早期的診斷和治療可控制病情發展，減少臟器破壞[1]，但至今尚無一種可確診pSS的指標。唇腺活檢和腮腺造影雖有較高的診斷特異性，但為有創檢查、費用高，其臨床應用受限。實驗室血清免疫學檢查中，抗SSA抗體、抗SSB抗體和類風濕因子對pSS診斷有重要意義[2]。抗SSA抗體是本病最常見的自身抗體，在pSS診斷中有較高的敏感性，但其特異性不高，在其他自身免疫性疾病中亦有較高的陽性率，易造成pSS的漏診和誤診[3]。miRNA是一類內源性的非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-UTR堿基互補配對，從而抑制mRNA翻譯或直接使其降解，導致靶基因的表達在轉錄后水平受到抑制，最終調控基因表達[4]。越來越多研究表明miRNA的異常表達與自身免疫性疾病的發生發展密切相關[5]。同時，近年來學者們發現miRNA在血清中能穩定存在，且能作為疾病診斷的一種新指標[6]。血清miRNA異常表達與諸多風濕免疫性疾病相關[7]。我們既往的研究顯示miR-155在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者血清中表達明顯下降，其用來診斷SLE的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.867，同時，miR-155低表達者對糖皮質激素反應優于高表達者，miR-155可作為SLE的治療靶點和預后因子[8]。2014年6月～2016年6月，我們觀察了抗SSA抗體陽性pSS患者血清中miR-34和miR-500表達變化，探討二者在診斷抗SSA抗體陽性pSS中的臨床價值，為早期診斷pSS提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年6月～2016年6月于江南大學附屬醫院和杭州師范大學附屬醫院就診的75例抗SSA抗體陽性pSS患者(觀察組)，男7例、女68例，年齡(43.7±9.3)歲。均符合2010年中華醫學會風濕病學分會發布的《干燥綜合征診斷及治療指南》pSS診斷標準。促甲狀腺激素(2.1±1.1)mU/L，血沉(19.8±14.4)mm/h，血清γ球蛋白(23.5±13.2)%，抗SSB陽性59例，類風濕因子陽性54例，涎腺腫大38例，口干56例，眼干50例。另選取同期抗SSA抗體陽性的非pSS患者84例作為對照組，男9例、女75例，年齡(45.2±11.6)歲。促甲狀腺激素(2.0±1.2)mU/L，血沉(9.9±7.8)mm/h，血清γ球蛋白(16.3±7.8)%，抗SSB陽性33例，類風濕因子陽性51例，涎腺腫大10例，口干49例，眼干48例。兩組患者性別、年齡、促甲狀腺激素水平、類風濕因子比較差異無統計學意義(P均>0.05)。兩組患者均從未接受過激素及其他風濕免疫性疾病的治療，本研究中患者均簽署知情同意書，并由江南大學附屬醫院倫理委員會審核通過。

1.2 兩組患者血清miRNA表達譜芯片分析 采集患者空腹靜脈血5 mL。血液采集后立即3 000 r/min，離心10 min，血清保存于-80 ℃冰箱待用。血清中總RNA的分離提取按照Qiagen公司miRNeasy血清miRNA柱式提取試劑盒的說明書進行。通過紫外熒光光度計確定RNA純度和濃度。按要求對RNA進行純化。純化后的RNA 進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。樣本保存于-80 ℃冰箱。隨機篩選6例抗SSA抗體陽性pSS患者血清和6例非pSS患者血清送至上海伯豪生物技術有限公司進行miRNA芯片分析。cDNA 制備采用Affymetrix 一步法 cDNA 合成試劑盒(Qiagen公司)，使用pCp-Cy3對總RNA進行標記，應用Agilent human miRNA芯片V12.0 檢測血清miRNA 的表達譜，該芯片含866個人類miRNA。采用Agilent 掃描儀對芯片結果掃描，并使用GCOS 軟件進行數據分析。

1.3 血清中miR-34和miR-500表達檢測 采用實時熒光定量RT-PCR法。為驗證芯片結果的可靠性，采用實時定量PCR對上調表達最明顯的2個miRNA進行驗證。將提取的RNA反轉錄成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件：16 ℃(30 min)，45 ℃(30 min)，85 ℃(5 min)。運用SYBR Green法檢測miR-34、miR-500表達，反應條件：95 ℃(10 min)預變性，95 ℃(15 s)，60 ℃(15 s)，72 ℃(10 s)，共循環40次。繪制擴增曲線，miR-34、miR-500的表達量采用2-ΔΔCt法進行相對定量。目的miRNA和內參(U6)分別在ABI7300型PCR儀中進行檢測，每組樣品重復3次。miR-34:上游引物5′-TGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-500：上游引物5′-ATGCACCTGGGCAAGG-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 結果

2.1 兩組血清miRNA表達譜比較 芯片檢測兩組血清miRNA表達譜的結果顯示，6個miRNA表達明顯上調，包括miR-34、miR-449a、miR-338、miR-500、miR-371和miR-483；4個miRNA明顯下調，包括miR-101、miR-145、miR-18a和miR-134，其中miR-34和miR-500上調最明顯(圖1)。

圖1 觀察組(A)和對照組(B)患者血清miRNA表達譜聚類圖

2.2 兩組血清中miR-34和miR-500表達比較 使用實時熒光定量RT-PCR對芯片數據進行驗證，發現觀察組與對照組血清中miR-34相對表達量分別為4.73±1.97、3.04±1.09；miR-500相對表達量分別為8.31±2.73、5.73±1.94；觀察組血清miR-34和miR-500表達量高于對照組(P<0.05)。

2.3 血清miR-34和miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的ROC曲線分析 miR-34診斷抗SSA抗體陽性pSS的AUC為0.783(95%CI:0.710～0.844,P<0.001)；miR-500診斷抗SSA抗體陽性pSS的AUC為0.774 (95%CI:0.701～0.837,P<0.001)；根據ROC曲線分析，我們可以確定miR-34和miR-500用于診斷的最佳cut-off值分別為3.2和6.3；miR-34在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的敏感性和特異性分別為61.9%和81.3%；miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的敏感性和特異性分別為64.3%和80.0%。

2.4 miR-34聯合miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的ROC曲線分析 用二分類Logistic回歸算得miR-34聯合miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷時其前系數(miR-34&miR-500)= 8.300 9-1.082 97* miR-34-0.590 28* miR-500。miR-34聯合miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的ROC分析結果見圖2。兩者聯合診斷的AUC值為0.888(95%CI: 0.828～0.932,P<0.001)，其診斷效能大于miR-34和miR-500單獨診斷的效能(P<0.001)。二者聯合在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的敏感性為92.8%，特異性為70.1%。

圖2 MiR-34聯合miR-500診斷pSS的ROC曲線

3 討論

pSS發病機制復雜，其發生發展是一個多基因調控、多階段、多步驟的復雜生物學過程。近年來，隨著基因組學及蛋白組學研究的日益成熟，人們開始探討更多更廣泛的pSS相關生物標志物，并對其發病機制進行深入探討[9]。

miRNA是一類進化上高度保守的短鏈非編碼RNA，不僅可游離于細胞外，還能穩定存在于血清中[10]。既往關于miRNA研究主要以腫瘤及腫瘤旁組織為標本，而這種以血清為樣本的取材，具有抽取便捷、創傷小、能反復操作的優點，可作為疾病標記物檢測的理想標本。目前的研究表明miRNA在不同疾病及同一疾病的不同病理進程中具有特定的表達譜，已在多種腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的診斷和預后中顯示出獨特的價值[11]。

本研究應用目前熱門的miRNA芯片技術，研究抗SSA抗體陽性pSS患者血清miRNA表達譜的改變，檢測miNRA在抗SSA抗體陽性pSS患者及非pSS患者血清中的表達情況，隨后實時熒光定量PCR進行驗證，發現miR-34和miR-500在抗SSA抗體陽性pSS患者血清中表達明顯增加。隨后，我們對這兩種miRNA的診斷效能進行評價。發現miR-34和miR-500診斷pSS的AUC值分別為0.783和0.774，但兩者的敏感性均不高，都在60%左右。如前所述，pSS發生機制復雜，參與其發病的基因可能種類繁多，并且目前疾病診斷的趨勢從單一指標檢測向多指標聯合評估發展[12]。同時，考慮到miRNA之間復雜的網絡關系，我們猜測兩者聯合診斷可提高敏感性和診斷效能。于是，我們采用二分類Logistic回歸算得miR-34聯合miR-500在pSS診斷時其前系數，得出兩者聯合診斷的AUC值為0.888，優于單一使用miR-34或miR-500的診斷效能，同時其敏感性提高到了92.8%，特異性高達70.1%。查閱文獻發現，Shi等[13]比較27例pSS患者和20例健康者血清miRNA表達量，發現miR-146明顯過表達，而miR-155卻表達下降。二者表達與口干、眼干、腮腺腫大存在相關關系。提示miR-146和miR-155可能參與pSS的發生發展并可作為診斷pSS的指標。Peng等[14]同樣發現以上2種miRNA在pSS中表達異常。此外，他們還發現miR-181a在pSS中表達上調，并推測其與B細胞的成熟緊密聯系。Gourzi等[15]檢測唾液腺組織和患者外周血中SSA和SSB mRNA和miNRA表達情況，發現miR16、miR200b-3p、miR223和miR483-5p表達存在異常，且與SSA抗體和SSB抗體mRNA存在相關關系，但并未深入研究其具體機制和以上這些miRNA在pSS中的臨床意義。該研究為本實驗提供了借鑒意義，于是篩選了至本院就診的SSA陽性患者作為研究對象，希望深入研究miRNA在抗SSA抗體陽性pSS中的作用。本研究初步確認了miR-34和miR-500在抗SSA抗體陽性pSS診斷中的作用，同時，miR-34和miR-500聯合檢測可在一定程度上提高診斷抗SSA抗體陽性pSS的敏感性和特異性，有望成為新的診斷模型。

綜上所述，本研究首次發現了miR-34和miR-500在抗SSA抗體陽性pSS患者血清中表達增加，miR-34和miR-500均可用于診斷抗SSA抗體陽性pSS。同時，二者聯合可提高兩個指標單獨診斷pSS的診斷效能和敏感性，是一種理想的診斷標志物。但本研究選擇對象為SSA陽性pSS患者，得出的結論為miR-34和miR-500可作為pSS診斷的指標。由于樣本量問題，并未對患者進行亞組分析，如繼續按臨床癥狀，是否合并內臟損害或其他慢性病，SSB抗體情況，其他實驗室檢查等進行分組，深入研究miRNA作為診斷指標的有效性。由于研究時間短，樣本量不足等問題，本研究并未設置另一組篩選人群驗證miR-34和miR-500在pSS中的診斷價值；我們將在后續的研究中，采用前瞻性研究進一步進行驗證，同時調查以上2種miRNA是否與pSS患者的治療效果相關，并隨訪觀察pSS患者的預后與miRNA之間的關系，進一步探究miR-34和miR-500在pSS早期診斷、治療及預后中的價值。

[1] Brito-Zerón P, Theander E, Baldini C, et al. Early diagnosis of primary Sjgren′s syndrome: EULAR-SS task force clinical recommendations [J]. Expert Rev Clin Immuno, 2016,12(2):137-156.

[2] Li X, Xu B, Ma Y, et al. Clinical and laboratory profiles of primary Sjogren′s syndrome in a Chinese population: a retrospective analysis of 315 patients [J]. Int J Rheum Dis, 2015,18(4):439-446.

[3] Corominas H, Ortiz-Santamaría V, Castellví I, et al. Nailfold capillaroscopic findings in primary Sjogren′s syndrome with and without Raynaud′s phenomenon and/or positive anti-SSA/Ro and anti-SSB/La antibodies [J]. Rheumatol Int, 2016,36(3):365-369.

[4] Shukla GC, Singh J, Barik S. MicroRNAs: Processing, maturation, target recognition and regulatory functions [J]. Mol Cell Pharmacol, 2011,3(3):83-92.

[5] Garo LP, Murugaiyan G. Contribution of MicroRNAs to autoimmune diseases [J]. CMLS, 2016,73(10):2041-2051.

[6] Turchinovich A, Weiz L, Langheinz A, et al. Characterization of extracellular circulating microRNA [J]. Nucleic Acids Res, 2011,39(16):7223-7233.

[7] Sonkoly E, Wei T, Janson PC, et al. MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis [J]. PLoS One, 2007,2(7):e610.

[8] 黃陽,葛曉松,吳平.系統性紅斑狼瘡患者血清miR-155水平變化及意義[J].山東醫藥,2016,56(45):27-30.

[9] Rose T, Szelinski F, Lisney A, et al. SIGLEC1 is a biomarker of disease activity and indicates extraglandular manifestation in primary Sjogren′s syndrome [J]. RMD Open, 2016,2(2):e000292.

[10] Gilad S, Meiri E, Yogev Y, et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers [J]. PLoS One, 2008,3(9):e3148.

[11] Zhao Y, Song Y, Yao L, et al. Circulating microRNAs: promising biomarkers involved in several cancers and other diseases [J]. DNA Cell Biol, 2017,36(2):77-94.

[12] Houben E, Bax WA, van Dam B, et al. Diagnosing ANCA-associated vasculitis in ANCA positive patients: A retrospective analysis on the role of clinical symptoms and the ANCA titre [J].Medicine (Baltimore), 2016,95(40):e5096.

[13] Shi H, Zheng LY, Zhang P, et al. miR-146a and miR-155 expression in PBMCs from patients with Sj?gren′s syndrome [J]. J Oral Pathol Med, 2014,43(10):792-797.

[14] Peng L, Ma W, Yi F, et al. MicroRNA profiling in Chinese patients with primary Sjogren syndrome reveals elevated miRNA-181a in peripheral blood mononuclear cells [J]. J Rheumatol, 2014,41(11):2208-2213.

[15] Gourzi VC, Kapsogeorgou EK, Kyriakidis NC, et al. Study of microRNAs (miRNAs) that are predicted to target the autoantigens Ro/SSA and La/SSB in primary Sjogren′s Syndrome [J]. Clin Exp Immunol, 2015,182(1):14-22.

Changes and diagnostic value of miRNA-34 and miRNA-500 in anti-SSA positive patients with primary Sjogren's syndrome

HUANGYang1,HUYunxia,GEXiaosong,WUPing

(1AffiliatedHospitalofJiangnanUniversity,Wuxi214000,China)

Objective To investigate the expression changes of serum miRNA-34 and miRNA-500 in anti-SSA positive patients with primary Sjogren's Syndrome (pSS) and to analyze their clinical value in diagnosis of anti-SSA positive pSS. Methods Serum samples were obtained from 75 anti-SSA positive patients with pSS (observation group) and 84 anti-SSA positive patients without pSS (control group). miRNA microarray was used to determine the alteration of miNRA expression profiles between the above two groups and the results were validated by RT-PCR. The value of miRNAs with abnormal expression in diagnosis of anti-SSA positive pSS were analyzed by using statistical methods.Results A total of 10 miRNAs showed altered expression in anti-SSA positive pSS patients, including 6 up-regulated miRNAs and 4 down-regulated miRNAs, among which, the most remarkable increase was observed in miR-34 and miR-500 of the observation group. Compared with the control group, the serum miR-34 and miR-500 were significantly increased in the observation group, bothP<0.001; receiver operating characteristic (ROC) analysis showed that, AUC value of miR-34 in diagnosing anti-SSA positive pSS was 0.783 (95%CI: 0.710-0.844,P<0.001), and AUC value of miR-500 was 0.774 (95%CI: 0.701-0.837,P<0.001) in the observation group; AUC value of miR-34 combined with miR-500 in diagnosis of anti-SSA positive pSS was 0.888 (95%CI: 0.828-0.932), which was superior to a single detector miR-34 or miR-500 (allP<0.05). Conclusion The expression of serum miR-34 and miR-500 in anti-SSA positive patients with pSS is increased, and the combined detection of miR-34 and miR-500 is helpful in diagnosis of anti-SSA positive pSS.

primary Sjogren's syndrome; anti-SSA antibody; miRNA-34; miRNA-500

亞太風濕病學會聯盟基金資助項目(2011)；江蘇省自然科學基金青年項目(BK20140171)。

黃陽(1974-)，女，副主任醫師，主要研究方向為干燥綜合癥的臨床研究。E-mail:wangyangjswx@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.007

R593

A

1002-266X(2017)25-0023-04

2017-03-10)